糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重與FUNDC1的關(guān)系探討

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糖尿病及其引發(fā)的各種慢性并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類健康[1]。心肌梗死是導(dǎo)致糖尿病病人死亡的重要原因。糖尿病是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以加重病人心肌梗死后心肌損傷。有研究表明，自噬在糖尿病及其誘發(fā)的心肌梗死等并發(fā)癥中發(fā)揮了重要作用[2]。自噬是機(jī)體的一種防御性機(jī)制，能減輕各種應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞損傷，維持器官正常功能，而抑制自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[3-4]。FUNDC1是一種特殊的細(xì)胞膜表面蛋白，在細(xì)胞缺氧時(shí)發(fā)生去磷酸化，通過(guò)特定結(jié)構(gòu)域與LC3-Ⅱ相互作用而啟動(dòng)自噬，減輕心肌細(xì)胞損傷[5]，而敲除小鼠的FUNDC1基因后自噬被抑制，缺血時(shí)心肌損傷加重[6]。糖尿病病人心肌梗死后缺血區(qū)心肌損傷增強(qiáng)與自噬的關(guān)系目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病大鼠心肌梗死模型，觀察自噬小體數(shù)量、去磷酸化FUNDC1和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)的變化，探討糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷增強(qiáng)與FUNDC1及其介導(dǎo)的自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔健康雄性SD大鼠60只，2～3月齡，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(NS組)、糖尿病+假手術(shù)組(DS組)、心肌缺血組(NI組)、糖尿病+心肌缺血組(DI組)，每組15只。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 DS組和DI組參照文獻(xiàn)[7]中的方法構(gòu)建大鼠糖尿病模型。大鼠禁食不禁水10 h后腹腔注射1%鏈脲佐菌素(批號(hào)：S0130，Sigma，美國(guó))60 mg/kg，普通動(dòng)物飼料喂養(yǎng)72 h后尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食和體重減輕，提示建模成功。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同步普通動(dòng)物飼料喂養(yǎng)8周，期間不進(jìn)行胰島素干預(yù)，觀察其行為表現(xiàn)，定時(shí)測(cè)量血糖。

1.3 心肌梗死模型建立 術(shù)前禁食不禁飲12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg，麻醉后仰臥固定于保溫工作臺(tái)上，連接BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)心電圖。經(jīng)頸正中切口暴露氣管，T形切口氣管插管后連接ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物科技有限公司)機(jī)械通氣，設(shè)置潮氣量8～10 mL，通氣頻率60次/min，吸呼比1∶2。參照文獻(xiàn)[8]中的方法，NI組和DI組大鼠經(jīng)胸骨左緣第4、5肋間沿肋骨切開(kāi)暴露心臟，用7-0絲線于左心耳下穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，絲線兩端穿過(guò)一細(xì)硅膠套管，收緊套管并持續(xù)固定造成結(jié)扎區(qū)域缺血，心電圖示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌顏色蒼白，表明心肌梗死模型成功。NS組和DS組只穿線不接扎。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定(TTC染色法) 心肌梗死6 h后每組隨機(jī)抽取5只大鼠，經(jīng)股靜脈逆行注入1%伊文氏藍(lán)染液3 mL，立即取出心臟，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。后將心臟橫切為5～6個(gè)薄片，每片厚2 mm左右，切片迅速置于2%TTC溶液中，37 ℃恒溫孵育15 min，清洗后用4%甲醛溶液固定15 min。可見(jiàn)藍(lán)色為正常組織，暗紅色為缺血心肌組織，灰白色為梗死組織。薄片掃描后用ImageProplus5.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國(guó))分析，測(cè)定缺血區(qū)梗死體積與缺血區(qū)心肌組織體積的百分比，反映心肌梗死體積。

1.5 病理及電鏡切片觀察 心肌梗死6 h后，隨機(jī)抽取各組部分心肌組織，經(jīng)石蠟切片制備、脫蠟、染色、脫水、封片后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織HE染色病理學(xué)結(jié)果。剩余5只大鼠部分組織切成1 mm×1 mm×1 mm大小，放入戊二醛磷酸鹽和鋨酸中固定，經(jīng)漂洗、脫水、包埋、切片后，經(jīng)醋酸雙養(yǎng)鈾與檸檬酸鉛雙重染色，JEM-2100型透射電鏡(×1 500，JEOL公司，日本)下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 FUNDC與LC3-Ⅱ檢測(cè) 取部分組織采用western-blot法測(cè)定FUNDC1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平。按照蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說(shuō)明，將大鼠心臟組織打碎后加入細(xì)胞裂解液，勻漿離心取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的分子量配制不同濃度的分離膠與濃縮膠，80 V電壓凝膠電泳90 min，轉(zhuǎn)膜后取出膜用TBS漂洗一次，用TBST配制5%脫脂牛奶，室溫下?lián)u床封閉1 h，TBST洗涮20 s后分別加入兔抗鼠單克隆去磷酸化FUNDC1抗體(ABclonal，A16318)和 兔抗鼠LC3-Ⅱ抗體(Proteintech，18725-1-AP)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗5 min×3次后加入HRP的山羊抗兔(1∶2 000，武漢博士德生物工程有限公司)二抗，4 ℃孵育2 h后，TBST漂洗3次，每次5 min。取適量ECL試劑盒(BIO-RAD，1705060)中等體積A液和B液混合，加到目的條帶附件避光反應(yīng)5 min。化學(xué)光敏模式曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，以去磷酸化FUNDC1條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比反映FUNDC1的去磷酸化水平；以LC3-Ⅱ條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比反映 LC3-Ⅱ的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比較 與NS組相比，DS組心肌梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NI組、DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)；與NI組相比，DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)。與NS組相比，DS組FUNDC1去磷酸化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NI組、DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；與NI組相比，DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)。與NS組相比，DS組、NI組、DI組LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；與NI組相比，DI組LC3-Ⅱ減少(P<0.05)。詳見(jiàn)表1、圖1、圖2。

表1 各組大鼠心肌梗死面積、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比較(±s)

與NS組比較，1)P<0.05；與DS組比較，2)P<0.05；與NI組比較，3)P< 0.05

圖1 各組大鼠心肌梗死面積TTC染色結(jié)果

圖2 各組大鼠心肌組織FUNDC1、LC3-Ⅱ western-blot檢測(cè)條帶

2.2 光鏡下觀察結(jié)果 NS組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)染色均勻，胞核居中，結(jié)構(gòu)完整；DS組心肌纖維排列稍紊亂，胞漿有輕度的腫脹，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；NI組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，心肌纖維排列紊亂或斷裂，胞漿有不同程度的腫脹甚至破裂，胞核排列不齊、碎裂和溶解；DI組心肌病理?yè)p傷程度較NI組增強(qiáng)，心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞崩解，細(xì)胞核溶解，染色加深，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織病理切片HE染色(×400)

2.3 電鏡下觀察結(jié)果 NS組心肌纖維排列規(guī)整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)較規(guī)整，嵴密集；DS組肌纖維排列較為整齊，部線粒體出現(xiàn)形態(tài)變化、分嵴數(shù)量減少或斷裂；NI組肌絲排列紊亂，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，嵴減少，并可見(jiàn)大量的自噬小體；DI組心肌細(xì)胞損傷明顯加重，肌絲溶解，隨處可見(jiàn)線粒體分裂，嵴斷裂溶解，自噬小體數(shù)量減少。詳見(jiàn)圖4。

圖4各組大鼠心肌組織透射電鏡切片觀察

3 討 論

本研究參照文獻(xiàn)[7]方法，禁食不禁水10 h后腹腔注射1%鏈脲佐菌素60 mg/kg建立大鼠糖尿病模型，給藥72 h后測(cè)量空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食和體重減輕，提示模型建立成功。同時(shí)參照文獻(xiàn)[8]的方法，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎后心電圖顯示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌組織顏色蒼白，TTC染色發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積增大，病理學(xué)與超微結(jié)構(gòu)損傷加重，提示大鼠心肌梗死模型制備成功。

急性心肌梗死是引起糖尿病病人死亡的重要原因，糖尿病病人對(duì)心肌缺血性損傷的易感性增加。糖尿病病人體內(nèi)存在糖和脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、糖基化產(chǎn)物堆積等眾多因素可以引起心肌結(jié)構(gòu)和功能破壞，使得心肌在應(yīng)對(duì)缺血缺氧時(shí)適應(yīng)性代償反應(yīng)減弱，損傷加重。近年來(lái)的研究表明，自噬在急性心肌梗死等缺血性心臟疾病中發(fā)揮了重要保護(hù)作用，能夠減少由心肌缺血引起的細(xì)胞死亡[9]；抑制自噬會(huì)導(dǎo)致心肌梗死后的缺血性損傷加重[10]。FUNDC1是缺氧誘發(fā)線粒體自噬所必需的一種新的線粒體相關(guān)膜蛋白[11]，普遍表達(dá)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，尤其是心臟。正常情況下酪氨酸激酶(SRC)可以通過(guò)促使FUNDC1磷酸化而不介導(dǎo)自噬發(fā)生。當(dāng)心肌梗死發(fā)生時(shí)，梗死血管供血區(qū)缺血缺氧，SRC失活導(dǎo)致FUNDC1發(fā)生去磷酸化，去磷酸化FUNDC1對(duì)LC3-Ⅱ有更強(qiáng)的親和力，能通過(guò)特定的結(jié)構(gòu)域募集LC3-Ⅱ并且發(fā)生相互作用而介導(dǎo)自噬[5]，對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)缺乏、應(yīng)激狀態(tài)等不利因素產(chǎn)生的影響。本研究結(jié)果表明，與NS組比較，NI組自噬小體數(shù)目增加，去磷酸化的FUNDC1增多，LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，提示FUNDC1參與了心肌細(xì)胞自噬以對(duì)抗梗死后心肌缺血性損傷。

糖尿病心肌細(xì)胞自噬的啟動(dòng)和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。研究表明，胰島素可以作為信號(hào)通過(guò)激活PI3K-Akt/PKB-mTOR通路抑制自噬的發(fā)生[12]。但糖尿病病人存在胰島素分泌不足或抵抗，自噬可能被激活。糖尿病病人體內(nèi)的高血糖、脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、鈣離子超載、各種炎癥介質(zhì)、胰島素樣物質(zhì)等因素也可以作用于自噬，發(fā)揮激活或者抑制自噬的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NS組相比，DS組自噬小體數(shù)目增加，LC3-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.05)，證明在糖尿病病人心肌細(xì)胞自噬水平升高。糖尿病病人心肌細(xì)胞表現(xiàn)出這種自噬狀態(tài)是各種激活和抑制因素共同作用的凈效應(yīng)。

FUNDC1是缺氧誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵蛋白。Zhang等[6]通過(guò)敲除小鼠的FUNDC1基因，發(fā)現(xiàn)心肌缺血時(shí)缺血區(qū)自噬受到抑制，心肌損傷加重。本研究顯示，與NI組相比，DI組大鼠病理學(xué)與超微結(jié)構(gòu)損傷加重，梗死面積增大，自噬小體數(shù)目減少，去磷酸化的FUNDC1減少，同時(shí)LC3-Ⅱ表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，提示糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重可能與梗死區(qū)心肌細(xì)胞去磷酸化的FUNDC1減少，自噬水平降低有關(guān)。有研究提示，糖尿病大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)的BCL-x可能是心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞FUNDC1去磷酸化減少的原因[14-16]，但具體的機(jī)制尚不明確，有待更進(jìn)一步研究。綜上所述，糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重可能與糖尿病抑制了梗死區(qū)心肌細(xì)胞FUNDC1去磷酸化有關(guān)。