IIFT法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體診斷特發(fā)性膜性腎病的效應(yīng)

姚麗莉，陳孝倩，黃朝興

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

M型磷脂酶A2受體（M-type phospholipase A2receptor，PLA2R）是成人特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）的主要靶抗原。BECK等[1]發(fā)現(xiàn)IMN患者血清抗-PLA2R抗體70%陽(yáng)性，且從腎活檢組織洗脫出的IgG可與PLA2R抗原起反應(yīng)。檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體現(xiàn)已成為診斷IMN的一個(gè)很有價(jià)值的非創(chuàng)傷性檢查手段。

目前檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體的方法最常用是ELISA法，其次是間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence testing，IIFT）法。有研究[2-3]提示IIFT法的敏感度略?xún)?yōu)于ELISA法。本研究以104例經(jīng)腎活檢診斷腎小球疾病患者為對(duì)象，分別采用IIFT法和ELISA法檢查血抗-PLA2R抗體，研究IIFT法對(duì)IMN診斷的靈敏度和特異度。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2016年1月至2017年7月間選擇溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢診斷腎小球疾病患者共104例，其中IMN 80例，繼發(fā)性膜性腎?。╯econdary membranous nephropathy，SMN）7例，非膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）17例。MN所有患者均為初次發(fā)病的病例。104例被隨機(jī)分為IIFT組40例和ELISA組64例，分別采取IIFT法和ELISA法檢測(cè)抗-PLA2R抗體，抽取清晨空腹血樣。本研究經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 成人IMN的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞16歲；②病理符合膜性腎?。虎叟懦到y(tǒng)性紅斑狼瘡等繼發(fā)性自身免疫病、乙型病毒性肝炎、腫瘤和藥物等繼發(fā)性因素。狼瘡性腎炎病理分型參照2003年由國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)和腎臟病理學(xué)會(huì)修訂的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（ISN/RPS）[4]。乙型肝炎病毒相關(guān)腎炎（nepatitis B-associated nephritis，HBV-GN）的診斷參照國(guó)內(nèi)腎活檢病理診斷標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意見(jiàn)[5]。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 IIFT法測(cè)定血清抗-PLA2R抗體：試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，按照試劑盒的操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行。由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟檢驗(yàn)室1位專(zhuān)職技師于顯微鏡下觀察熒光模型判讀結(jié)果。顯微鏡下產(chǎn)生明顯高于陰性對(duì)照的特異熒光，且有鮮明可以辨認(rèn)的熒光模式，判定為陽(yáng)性。

1.3.2 ELISA法測(cè)定血清抗-PLA2R抗體：送檢樣本由杭州金域檢測(cè)公司檢測(cè)完成。試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，酶標(biāo)儀測(cè)量光密度（OD值）及濃度。陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抗-PLA2R抗體濃度＞14 RU/mL記錄結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或百分比表示。正態(tài)計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組IMN患者一般情況比較 IIFT組和ELISA組IMN患者的年齡、性別、血漿白蛋白、尿蛋白定量、血脂差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組IMN患者一般情況比較

2.2 IIFT法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體 IIFT組采用IIF法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體40例，其中33例IMN，陽(yáng)性26例，敏感度為78.8%；2例SMN（腫瘤合并MN）均陰性。設(shè)為組內(nèi)對(duì)照的非MN 5例（微小病變腎病2例，狼瘡性腎炎IV型、乙型肝炎病毒相關(guān)性系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎、IgA腎病各1例），其中1例狼瘡性腎炎IV型可疑陽(yáng)性，其余患者均陰性。IIFT法檢測(cè)血抗-PLA2R抗體陽(yáng)性的信號(hào)見(jiàn)圖1。

圖1 IIFT法血清抗-PLA2R抗體陽(yáng)性（免疫熒光染色，×400）

2.3 ELISA法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體 ELISA組采用ELISA法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體64例，其中IMN 47例，陽(yáng)性37例，敏感度為78.7%；SMN 5例（狼瘡性腎炎V型2例，慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN 1例、干燥綜合征合并MN 1例和結(jié)腸癌合并MN 1例），其中1例慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN和1例結(jié)腸癌合并MN患者血抗-PLA2R抗體陽(yáng)性，其余均為陰性。設(shè)為組內(nèi)對(duì)照的非MN 12例（局灶節(jié)段性腎小球硬化4例，微小病變2例，淀粉樣病變2例，IgA腎病、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病各1例）均為陰性。

3 討論

BECK等[1]采用Western blot法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體對(duì)IMN診斷的靈敏度為70%，特異度為100%。目前，檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體的方法有4種：ELISA、IIFT、Western blot和時(shí)間分辨熒光分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA），國(guó)內(nèi)可用于臨床的有證產(chǎn)品目前僅2種：ELISA法和IIFT法。Meta分析[6]顯示，采用不同檢測(cè)方法對(duì)IMN診斷總的靈敏度為65%（63%～67%），特異度為97%（97～98%）；其中ELISA法集成的診斷OR（95%CI）為45.53（26.78～77.38），無(wú)異質(zhì)性，曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.9348；IIFT法集成的診斷OR（95%CI）為40.77（19.00～87.50），異質(zhì)性為61.7%，AUC為0.9296。

研究[7]顯示，采用Western blot、IIFT以及ELISA法這3種方法對(duì)血清抗-PLA2R抗體的檢出率是存在一些差別的。HOFSTRA等[2]研究了117例IMN，血清中抗-PLA2R抗體的檢測(cè)陽(yáng)性率在IIFT法和ELISA法分別為74%和72%，2種方法的一致性較好（94%一致，κ=0.85）。DAHNRICH等[3]對(duì)200例采用IIFT法證實(shí)的PLA2R相關(guān)性膜性腎病（PLA2R-MN）患者同時(shí)用ELASA法檢測(cè)，結(jié)果有7例陰性。在HOFS-TRA等[2]研究的117例PLA2R-MN中，5例IIFT陽(yáng)性但ELISA陰性，2例IIFT陰性而ELISA陽(yáng)性。管音等[8]對(duì)59例IMN采用IIFT法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為69.5%，特異度為95.2%。本研究結(jié)果顯示，IIFT法檢測(cè)IMN血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為78.8%，ELISA法檢測(cè)IMN血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為78.7%。

在本研究結(jié)合臨床和病理確診的IMN患者中，分別有21.2%（7/33）經(jīng)IIFT法檢測(cè)和21.3%（10/47例）經(jīng)ELISA法檢測(cè)結(jié)果為陰性，可能的解釋為：①采集患者血樣時(shí)，部分患者可能正處在疾病緩解過(guò)程中，即患者可能正處于一種低水平的免疫活動(dòng)狀態(tài)，使體內(nèi)的抗體水平處于一種低滴度狀態(tài)，使用的試劑未能檢測(cè)出其結(jié)果。HOFSTRA等[7]檢測(cè)18例IMN患者體內(nèi)的血清抗-PLA2R抗體，其中14例陽(yáng)性，1例陰性，4個(gè)月后再次對(duì)陰性患者檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清中抗-PLA2R抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。②IMN患者除了PLA2R以外，可能還存在其他自身靶抗原，已發(fā)現(xiàn)部分抗-PLA2R抗體陰性的IMN患者體內(nèi)可以檢測(cè)到血小板反應(yīng)蛋白7A域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A）的自身抗體。但HOXHA等[9]的研究顯示，THSD7A也可能是腫瘤組織釋放的抗原，由機(jī)體免疫識(shí)別后產(chǎn)生循環(huán)中相應(yīng)抗體，這些抗體可特異性結(jié)合腎小球足細(xì)胞上的THSD7A抗原形成免疫復(fù)合物導(dǎo)致MN。③抗-PLA2R抗體的檢測(cè)結(jié)果受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)靶抗原的構(gòu)象和表達(dá)水平的影響，造成抗體檢測(cè)結(jié)果的誤差。

HOFSTRA等[2]研究了82例PLA2R-MN，血清抗-PLA2R抗體滴度與基線(xiàn)尿蛋白水平顯著相關(guān)（P=0.02），高抗體滴度患者的自然緩解率明顯較低（最低滴度為38%，最高滴度為4%；P＜0.01）。本研究2組IMN的尿蛋白定量和血漿白蛋白水平均無(wú)明顯差別，可基本排除疾病嚴(yán)重程度對(duì)不同方法檢測(cè)抗-PLA2R抗體敏感度的影響。

鑒于檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體對(duì)IMN診斷具有高度特異性，一般認(rèn)為血清抗-PLA2R抗體陽(yáng)性診斷IMN幾乎是不用懷疑的。在本研究中，1例直腸癌合并膜性腎病患者抗-PLA2R抗體陽(yáng)性，該例腎活檢組織免疫熒光以IgG4為主，在直腸癌切除術(shù)后5月腎病仍未緩解，提示該例可能為腫瘤合并IMN。

另1例ELISA法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體陽(yáng)性為慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN，該患者乙肝大三陽(yáng)，HBV-DNA陽(yáng)性，腎活檢免疫熒光IgG4為主，腎組織HBsAg和HBcAg陰性；電鏡下伴副系膜區(qū)電子致密物。該例雖然尚不能確診為乙肝病毒相關(guān)性MN，也不能完全排除之。此外，ELISA組12例非MN均陰性，本研究ELISA法的特異度為94.1%（16/17例）。

IIFT組的2例SMN檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體均為陰性，但組內(nèi)對(duì)照5例中有1例狼瘡性腎炎IV型（病理結(jié)果為彌漫增生型腎小球腎炎，結(jié)合電鏡已排除合并狼瘡性腎炎V型）為可疑陽(yáng)性，推測(cè)這可能是由抗核抗體引起的。一項(xiàng)涉及SMN患者抗-PLA2R抗體的研究[10]顯示，5%的V型狼瘡性腎炎可檢測(cè)到該抗體。本研究IIFT法的特異度為85.7%（6/7），特異度偏低可能與組內(nèi)SMN及對(duì)照的例數(shù)較少有關(guān)。

在成人IMN的診斷上，IIFT法檢測(cè)血清抗-PLA2R抗體的靈敏性和特異度與ELISA法大致相當(dāng)，這2種方法對(duì)診斷IMN均具有很好的實(shí)用價(jià)值。本研究尚存在一些局限性，如未在同一例患者同時(shí)進(jìn)行2種方法檢測(cè)、未檢查腎組織內(nèi)PLA2R及入組的SMN患者例數(shù)不夠多等，今后有待擴(kuò)大樣本量、結(jié)合2種方法及腎組織內(nèi)PLA2R檢查進(jìn)一步研究。