細胞自噬在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究進展

金恒凱 王瑞 汪正明 項思成 呂帥潔

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的退行性骨關(guān)節(jié)病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹和功能受限等，對患者的睡眠質(zhì)量、心理健康、社會參與度等均有影響。據(jù)估計全球約有2.4 億人患有癥狀性O(shè)A，但目前暫無藥物能有效地逆轉(zhuǎn)OA 的病理過程[1]。而細胞自噬是一種能將細胞內(nèi)物質(zhì)降解再利用的復(fù)合分子途徑，在維持軟骨細胞的存活和軟骨基質(zhì)的完整性等方面發(fā)揮重要作用，被視為OA 治療的潛在靶點[2]。本文就細胞自噬在OA發(fā)病中的作用研究進展作一綜述。

1 細胞自噬概述

細胞自噬是一種將細胞質(zhì)物質(zhì)（受損的細胞器、長壽命蛋白等）輸送到溶酶體/液泡進行降解和循環(huán)利用的復(fù)合分子途徑，主要分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬3 種形式[3]。其中巨自噬是最常見的細胞自噬類型，在應(yīng)激因素的刺激下，細胞內(nèi)依次形成雙層膜結(jié)構(gòu)的碗狀吞噬泡、完全密閉的球狀自噬體和自噬溶酶體，最后自噬溶酶體將包裹的內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物回到細胞質(zhì)內(nèi)循環(huán)利用[4]。除非明確注明，在OA 領(lǐng)域的研究文獻中所講的細胞自噬指的就是巨自噬這一主要形式。細胞自噬現(xiàn)象在包括酵母菌和哺乳動物在內(nèi)的真核生物中廣泛存在。目前已經(jīng)在酵母中篩選確定了40 多個自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG），在哺乳動物中也存在許多酵母ATG 的同源基因，其中以下幾個ATG 編碼的蛋白質(zhì)在相關(guān)研究中出現(xiàn)較多：（1）微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubul-associated protein 1 light chain 3，LC3）是ATG8的同源蛋白，膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ與胞質(zhì)形式的LC3-Ⅰ的比值可反映細胞自噬水平的高低；（2）UNC-51 樣激酶1（UNC51-like kinase 1，ULK1）是ATG1 的同源蛋白，參與自噬的啟動并作為腳手架募集其他自噬相關(guān)蛋白，對ULK1 的檢測可以反映自噬誘導(dǎo)的情況；（3）Beclin1 蛋白是ATG6 的同源蛋白，除了作為磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）復(fù)合體的亞基參與自噬調(diào)控外，其還能與B 細胞淋巴瘤-2 家族蛋白互作參與細胞凋亡的調(diào)控[5]。

2 細胞自噬與OA

2.1 軟骨細胞自噬與OA 有研究表明軟骨細胞自噬水平隨衰老而逐漸降低，而細胞自噬水平的下降加速了OA 的兩個典型病理過程：軟骨細胞數(shù)目減少和軟骨基質(zhì)降解[6]。在OA 發(fā)病中軟骨細胞自噬缺陷導(dǎo)致軟骨細胞數(shù)目減少的機制是軟骨細胞自噬清除受損的細胞器、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、長壽命蛋白、錯誤折疊的蛋白質(zhì)的效率降低，能量代謝的紊亂、氧化應(yīng)激的增多和凋亡相關(guān)基因的表達上調(diào)最終誘發(fā)軟骨細胞凋亡[7]。Carames 等[2]發(fā)現(xiàn)人軟骨細胞中ULK1、Beclin1 和LC3 等自噬相關(guān)蛋白的水平隨細胞衰老而降低，而衰老軟骨細胞的自噬缺陷誘發(fā)了OA 中的軟骨細胞凋亡。Xin 等[8]研究發(fā)現(xiàn)磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導(dǎo)激酶1/Parkin 通路介導(dǎo)的線粒體自噬能抑制OA 中ROS 的產(chǎn)生并提高人軟骨細胞的存活率，表明線粒體自噬能有選擇性地清除受到損傷或功能紊亂的線粒體以維持線粒體質(zhì)量控制，避免軟骨細胞因過度氧化應(yīng)激而凋亡[9]。以上研究表明，軟骨細胞自噬的激活有助于維持能量供應(yīng)和能量代謝的穩(wěn)定，并抑制OA 中的軟骨細胞凋亡。

在OA 發(fā)病中軟骨細胞自噬缺陷導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解的潛在機制是衰老軟骨細胞分泌的炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）增多，同時衰老軟骨細胞的自噬水平下調(diào)導(dǎo)致清除致炎因子的能力下降，最終加速了軟骨基質(zhì)的降解[10-11]。Huang 等[12]發(fā)現(xiàn)人軟骨細胞自噬的激活能降低軟骨組織MMPs 水平并提高Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖水平，表明OA 中的軟骨細胞自噬通過減少軟骨組織的分解以保持軟骨基質(zhì)的完整性。Xue 等[13]發(fā)現(xiàn)IL-1β 誘導(dǎo)的炎癥能抑制OA 大鼠的軟骨細胞自噬，而上調(diào)衰老軟骨細胞自噬能減輕炎癥反應(yīng)，提示細胞自噬的激活通過降解關(guān)節(jié)中的炎癥介質(zhì)、抑制OA 中炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)起到軟骨保護作用。以上研究表明，通過清除炎癥因子、降低MMPs 的水平、減輕炎癥反應(yīng)，軟骨細胞自噬減少了OA 中的軟骨基質(zhì)的降解。

還有研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬在OA 各階段產(chǎn)生的效應(yīng)不盡相同。在短期的應(yīng)激刺激下，OA 早期軟骨細胞自噬水平上調(diào)，幫助細胞適應(yīng)不良環(huán)境，抑制細胞凋亡；但在長期高于閾值的應(yīng)激刺激下，細胞自噬可能參與誘導(dǎo)OA 晚期的軟骨細胞轉(zhuǎn)向凋亡[14]。此外，有研究認為酸敏感離子通道1a 通過激活細胞自噬加速了酸誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老，但由于細胞自噬過程中的溶酶體活性上調(diào)可能影響衰老檢測中常用的β-半乳糖苷酶染色的準確性，這一結(jié)論仍存在爭議[15-17]。

2.2 滑膜細胞自噬與OA 滑膜細胞可分為巨噬細胞樣細胞（macrophage-like synoviocytes，MLS）和成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）。在OA發(fā)病過程中，軟骨分解產(chǎn)物釋放到關(guān)節(jié)滑液中，并被MLS 吞噬進而誘發(fā)滑膜炎癥，炎癥介質(zhì)的增多又誘導(dǎo)MMPs 的過量產(chǎn)生加劇軟骨降解，形成的正反饋機制加重了OA 的進展，而滑膜細胞自噬起到了阻斷惡性循環(huán)、恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[18]。Ni 等[19]發(fā)現(xiàn)人類MLS 自噬水平下調(diào)導(dǎo)致炎性小體的激活和成熟IL-1β 的增多，表明滑膜巨噬細胞自噬可能通過降解炎癥介質(zhì)和抑制炎癥小體的激活緩解OA 中的滑膜炎。而FLS 則能分泌長鏈透明質(zhì)酸潤滑關(guān)節(jié)，衰老FLS 產(chǎn)生的關(guān)節(jié)滑液減少是導(dǎo)致OA 中軟骨磨損的重要原因。Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 介導(dǎo)的N6-甲基腺嘌呤修飾通過降低ATG7 基因的表達導(dǎo)致FLS 自噬受損，而FLS 的自噬缺陷通過上調(diào)衰老基因GATA4 的表達加速FLS 衰老并最終促進OA 中的軟骨降解，提示表觀遺傳修飾在OA 的FLS 自噬調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

2.3 細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）與OA EVs是一類細胞分泌或外膜脫落而成的囊泡狀膜結(jié)構(gòu)，可大致分為外泌體和微囊泡兩大類，而生長板軟骨細胞產(chǎn)生的鈣化EVs 與OA 中的病理性軟骨鈣化密切相關(guān)[21-22]。Yan 等[23]的研究首次發(fā)現(xiàn)來源于軟骨細胞含礦物質(zhì)自噬體的LC3+鈣化EVs 是啟動顳下頜關(guān)節(jié)OA早期病理性軟骨鈣化的關(guān)鍵因素，并進一步闡明組蛋白去乙?；? 介導(dǎo)的微管失穩(wěn)導(dǎo)致了自噬通量受損引起了LC3+鈣化EVs 的釋放,這一全新的病理生理機制揭示了細胞自噬作為一種分泌過程在OA 的病理性軟骨鈣化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4 成骨細胞/破骨細胞自噬與OA 成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收之間的不平衡是導(dǎo)致OA 中軟骨下骨硬化、骨重塑異常和骨贅形成的關(guān)鍵因素[24]。Wan 等[25]發(fā)現(xiàn)人類成骨細胞中的15-脂氧合酶-1 通過抑制OA 中的成骨細胞自噬促進轉(zhuǎn)化生長因子-β 的表達，導(dǎo)致軟骨下骨結(jié)構(gòu)的異常變化。Wang 等[26]發(fā)現(xiàn)OA 早期的成骨細胞自噬受損導(dǎo)致礦化減少，而上調(diào)細胞自噬能促進成骨細胞礦化以防止關(guān)節(jié)軟骨退變，兩項研究都表明了成骨細胞自噬參與維持軟骨下骨結(jié)構(gòu)的正常。目前破骨細胞自噬在OA 中的作用和分子機制尚不明確，Zhang 等[27]通過生物信息學(xué)分析鑒定出Beclin1、磷酸肌醇-3-激酶3 基因、GABA-A 受體關(guān)聯(lián)蛋白樣蛋白2 基因、ATG3 和ATG12 這5 個參與OA中破骨細胞自噬的關(guān)鍵基因，并通過體內(nèi)和體外實驗證實在小鼠OA 模型中自噬基因和破骨細胞活化之間存在高度相關(guān)性，這一研究從破骨細胞自噬的角度為OA 發(fā)病的分子機制提供了新的見解。

3 OA 中調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子及信號通路

3.1 自噬調(diào)控關(guān)鍵分子

3.1.1 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） mTOR 是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是OA 相關(guān)研究中最重要的自噬負性調(diào)控因子。mTORC1 對細胞自噬的負向調(diào)節(jié)作用主要是通過抑制ULK1/ATG13 蛋白的磷酸化和抑制轉(zhuǎn)錄因子EB 的活性實現(xiàn)的。在營養(yǎng)充足的情況下，上游的激素或生長因子通過PI3K/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）等信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活mTORC1，以促進合成代謝并抑制細胞自噬[28]；相反在營養(yǎng)缺乏的情況下，mTORC1 的活性降低，使得合成代謝被抑制而細胞自噬被激活。mTOR 接受Akt、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）、結(jié)節(jié)性硬化蛋白2（tuberous sclerosis protein 2，TSC2）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p53 蛋白、叉頭框蛋白O（forkhead box O，F(xiàn)OXO）在內(nèi)的眾多上游信號分子的調(diào)控，是多條重要信號通路交匯的“樞紐”，在OA 的自噬調(diào)控中起到關(guān)鍵作用[29]。

3.1.2 沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2 同源蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin/SIRT） Sirtuin 家族蛋白是一類NAD+依賴性脫乙酰酶[30]，哺乳動物的Sirtuin 家族蛋白有SIRT1～SIRT7 等7 個成員，它們的活性受上游的AMPK、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等信號分子的調(diào)控[31]。Liao 等[32]發(fā)現(xiàn)SIRT1 能與ATG7 蛋白相互作用，誘導(dǎo)細胞自噬的激活以抑制軟骨細胞的衰老和凋亡，表明SIRT1 能直接與ATG 編碼的蛋白結(jié)合誘導(dǎo)軟骨細胞自噬。Lu 等[33]發(fā)現(xiàn)SIRT1 能通過去乙?；抡{(diào)磷酸酶及張力蛋白同源物基因的表達進而抑制表皮生長因子受體的泛素化，激活小鼠軟骨細胞自噬從而延緩OA 進展，表明OA 發(fā)病中SIRT1 還能通過乙?；{(diào)控自噬相關(guān)的酶/轉(zhuǎn)錄因子的活性。此外，Xu 等[34]還發(fā)現(xiàn)另一個定位于線粒體的Sirtuin 家族蛋白SIRT3 能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活軟骨細胞自噬起到軟骨保護作用。

3.1.3 FOXO 蛋白家族 FOXO 蛋白家族在哺乳動物中有4 個成員：FOXO1、FOXO3a、FOXO4 和FOXO6，其中FOXO1 和FOXO3a 是軟骨細胞自噬激活的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子[35]。Akasaki 等[36]發(fā)現(xiàn)下調(diào)軟骨細胞中FOXO1/3 的表達能引起自噬相關(guān)蛋白的減少,增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的敏感性，提示OA 發(fā)病中FOXO 蛋白可能通過促進ATG 的轉(zhuǎn)錄激活細胞自噬，以幫助軟骨細胞對抗氧化應(yīng)激。Kuwahara 等[37]發(fā)現(xiàn)FOXO3 通過促進人軟骨細胞內(nèi)C10orf10 基因/孕酮誘導(dǎo)的蛻膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）的表達激活線粒體自噬，表明FOXO 蛋白還參與線粒體自噬以維持軟骨細胞的線粒體質(zhì)量控制。

3.1.4 非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA） ncRNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在細胞自噬調(diào)控領(lǐng)域被研究最多的非編碼RNA 是microRNA，miRNA、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。miRNA 是指長度為19～25個核苷酸的小分子RNA，它能通過與靶mRNA 轉(zhuǎn)錄本的3'TU 互補配對沉默靶基因。研究表明，許多不同的miRNA 通過降解mRNA、抑制蛋白翻譯等方式參與OA中的自噬調(diào)控[38]。Kim 等[39]發(fā)現(xiàn)miR-126-5p 通過與過氧化物酶體增殖受體γ 輔激活因子α（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator α，PGC-1α）非翻譯區(qū)結(jié)合抑制PGC-1α 的表達激活軟骨細胞線粒體自噬，提示miRNA 具有靶向軟骨細胞自噬以治療OA的臨床潛力。

lncRNA 指的是長度＞200 個核苷酸的ncRNA，其通過調(diào)控靶基因表達、干擾mRNA 的剪切、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性等多種方式調(diào)控OA 中的細胞自噬。Wen等[40]發(fā)現(xiàn)lncRNA KLF3-AS1 能通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制軟骨細胞的自噬，Tian 等[41]發(fā)現(xiàn)lncRNA 小核仁RNA 宿主基因7 能通過與miR-34a-5p競爭性結(jié)合調(diào)控滑膜蛋白1 基因的表達從而影響OA中的軟骨細胞自噬，表明lncRNA 可以通過與miRNA結(jié)合間接參與OA 中細胞自噬的調(diào)控。

circRNA 則是由反式剪接產(chǎn)生的共價閉合的RNA。Man 等[42]發(fā)現(xiàn)Ras 同源基因家族成員T1 能抑制miR-142-5p 與靶基因的結(jié)合，促進細胞周期蛋白D1基因的表達從而下調(diào)軟骨細胞自噬水平，表明circRNA 能作為miRNA 海綿間接調(diào)控miRNA 靶基因的表達，進而參與OA 中的細胞自噬調(diào)控。

3.2 自噬調(diào)控信號通路

3.2.1 PI3K/Akt/mTOR 信號通路 PI3K/Akt/mTOR 信號通路是OA 相關(guān)研究中受關(guān)注最多的信號通路。PI3K 可分為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類,目前對Ⅰ類PI3K 的研究最為透徹。生長因子、胰島素等細胞外刺激能通過刺激酪氨酸激酶受體和G 蛋白偶聯(lián)受體激活Ⅰ類PI3K，之后Ⅰ類PI3K 通過活化Akt蛋白激活下游的mTORC1，并最終抑制OA 中的細胞自噬[43]。Shi 等[44]發(fā)現(xiàn)泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白1 可通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路增強細胞自噬以減少OA 中的軟骨細胞凋亡，提示表觀遺傳調(diào)節(jié)因子在OA 發(fā)病中參與調(diào)控軟骨細胞凋亡。

3.2.2 AMPK/mTOR 信號通路 AMPK 是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的異源三聚體蛋白復(fù)合物，能通過監(jiān)測AMP 比ATP 和ADP 比ATP 的比例感知細胞中的能量變化[45]。AMPK 不僅能直接磷酸化ULK1/2 促進細胞自噬[46]，還能通過多種途徑抑制下游的mTOR 從而激活細胞自噬。Li 等[47]發(fā)現(xiàn)中等強度運動通過嘌呤能離子通道型受體7/AMPK/mTOR 信號軸促進軟骨細胞自噬以避免細胞焦亡，提示OA 中運動療法能激活軟骨細胞自噬。Wang 等[48]發(fā)現(xiàn)高血糖不僅能通過AMPK/mTOR 通路抑制軟骨細胞自噬，還能誘發(fā)軟骨細胞的氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞自噬水平上調(diào)，這項研究揭示了高血糖對軟骨細胞自噬的雙重效應(yīng)，為骨關(guān)節(jié)炎合并糖尿病的患者提供了新的用藥策略。

3.2.3 TSC/腦Ras 同源蛋白（ras homolog enriched in brain，Rheb）/mTOR 信號通路 結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白復(fù)合體（tuberous sclerosis protein complex，TSCC）能通過將Rheb 從活性形式轉(zhuǎn)化為非活性形式，抑制mTORC1活性從而激活OA 中的細胞自噬[49]。Lv 等[50]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過介導(dǎo)TSC2/Rheb/mTOR 信號通路誘導(dǎo)小鼠軟骨細胞自噬以緩解OA，表明利用天然生物活性物質(zhì)激活TSC/Rheb/mTOR 通路誘導(dǎo)軟骨細胞自噬是具有較大潛力的OA 治療方式。

4 小結(jié)與展望

目前OA 仍是骨科臨床治療的難題。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、維持能量穩(wěn)態(tài)、維持骨代謝平衡，適度的細胞自噬不僅在OA發(fā)病中減緩軟骨降解，還參與糾正各組織內(nèi)存在的代謝紊亂，表明以細胞自噬為靶點的藥物和療法具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

但將自噬激活劑轉(zhuǎn)化為臨床用藥仍有許多障礙。在生物學(xué)機制方面，細胞自噬在OA 發(fā)病不同階段的作用機制仍未闡明，細胞自噬上下游復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待厘清；在藥物開發(fā)方面，許多自噬誘導(dǎo)劑的不良反應(yīng)明顯，目前尚缺乏能精準調(diào)控軟骨細胞自噬的靶向藥物；在臨床試驗方面，目前的研究主要采用動物模型和細胞體外實驗，缺乏高質(zhì)量的臨床試驗數(shù)據(jù)以有力地證明相關(guān)療法的有效性。因此，對OA 中自噬的作用機制做更深入的研究、以自噬為靶點尋找和開發(fā)適用于臨床的OA 治療藥物、開展相關(guān)藥物和療法的多中心大樣本隨機雙盲對照試驗十分必要。