離子液體在蝦殼甲殼素提取中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李 艷 高 靜,2,3 何曉燕 嚴(yán)來(lái)喜

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

甲殼素又名幾丁質(zhì)，是地球上蘊(yùn)藏量最豐富的有機(jī)物之一。如圖1所示，甲殼素是由β-1,4-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接起來(lái)的線性高分子多糖[1]，脫乙酰度達(dá)到50%以上的甲殼素又被稱(chēng)為殼聚糖[2]。甲殼素及殼聚糖因具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性和熱化學(xué)穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織等領(lǐng)域[3]。地球上每年甲殼素的生物合成量約為100億t，是年產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的可再生天然資源[4-5]。海產(chǎn)品加工副產(chǎn)物蝦、蟹殼是甲殼素的主要原料，占生物合成甲殼素總量的80%[6]。從水產(chǎn)品加工下腳料中提取回收甲殼素不僅可以緩解資源浪費(fèi)，而且使副產(chǎn)物得到高值化利用[7]。

圖1 甲殼素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

蝦殼主要含有甲殼素15%～25%、碳酸鈣25%～50%、蛋白質(zhì)35%～50%[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，工業(yè)提取甲殼素采用強(qiáng)酸脫碳酸鈣和堿脫蛋白質(zhì)。此方法對(duì)酸、堿需求量大，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。而且，堿處理會(huì)導(dǎo)致甲殼素部分脫乙酰和聚合物水解，使甲殼素分子量降低[8-9]。近年來(lái)，微生物發(fā)酵法和酶法提取甲殼素因反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好和耗能少等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，但提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低和脫蛋白不充分等缺陷限制了其工業(yè)化應(yīng)用[10]。

離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成的低溫熔融鹽，又稱(chēng)室溫熔鹽，具有可設(shè)計(jì)性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[11-13]。對(duì)纖維素、甲殼素等多糖有很強(qiáng)的溶解能力[14-16]。近年來(lái)，利用離子液體從蝦殼中提取回收甲殼素的研究得到了廣泛關(guān)注[17-19]。文章主要從甲殼素和蝦殼在離子液體中的溶解特性、甲殼素提取物成分分析以及結(jié)構(gòu)表征3個(gè)方面綜述以離子液體為溶劑從蝦殼中提取回收甲殼素的研究進(jìn)展，旨在為對(duì)蝦加工下腳料的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 甲殼素在離子液體中的溶解性

1.1 離子液體的陰離子對(duì)甲殼素溶解度的影響

離子液體(ILs)具有“可設(shè)計(jì)性”，不同陰、陽(yáng)離子組合的離子液體對(duì)物質(zhì)的溶解能力不同[20-21]，表1列舉了甲殼素在多種離子液體中的溶解度。離子液體的氫鍵接受能力(β值)受其陰離子支配，具有較強(qiáng)氫鍵接受能力的陰離子(如Ac-、Br-、Cl-)容易與甲殼素氨基上的H原子形成穩(wěn)定的氫鍵，從而促進(jìn)甲殼素的溶解[29]。Qin等[23]發(fā)現(xiàn)在100 ℃、19 h條件下甲殼素在[Emim]Ac中的溶解度可達(dá)15.2%，而在[Emim]Cl中的溶解度僅為4.2%。類(lèi)似的，甲殼素在[Amim]Cl和[Amim]Ac中的溶解度分別為0.5%[24]和5.0%[25]。一般情況下，離子液體的陰離子對(duì)甲殼素溶解能力順序?yàn)椋篈c->Cl-。

表1 甲殼素在不同離子液體中的溶解度?

? “-”表示文獻(xiàn)中未指出。

1.2 離子液體的陽(yáng)離子對(duì)甲殼素溶解度的影響

咪唑類(lèi)離子液體溶解甲殼素的能力較吡咯烷、哌啶和哌嗪類(lèi)離子液體強(qiáng)，因?yàn)檫溥蚧x子液體結(jié)構(gòu)中包含1個(gè) 5元環(huán)，比6元環(huán)組成的離子液體顯示出更高供給質(zhì)子的能力和更強(qiáng)的酸性[29]。此外，由于陽(yáng)離子疏水性和黏度均隨烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增大，不利于分子的溶解[30]。不僅如此，受陽(yáng)離子烷基鏈官能團(tuán)的影響，甲殼素在Cl-基離子液體中的溶解度關(guān)系為[Emim]+>[Amim]+>[C2OHmim]+[23-24]。因此，體積小、極性強(qiáng)的陽(yáng)離子[Emim]+能夠與甲殼素中—OH的氧原子和—NH 的氮原子產(chǎn)生較強(qiáng)的氫鍵作用。

如圖2所示，離子液體溶解甲殼素的機(jī)理為：陰離子與甲殼素的乙酰胺基和羥基形成氫鍵，削弱了甲殼素分子內(nèi)和分子間氫鍵作用，導(dǎo)致甲殼素分子鏈的扭曲和剝落。同時(shí)，離子液體的陽(yáng)離子穿透甲殼素分子鏈之間的空隙，防止剝離后結(jié)晶相的恢復(fù)。最后，甲殼素鏈以完全分離的分子形式分散在離子液體中[31]。

2 離子液體提取蝦殼中甲殼素的工藝

[Emim]Ac等離子液體對(duì)甲殼素的良好溶解性，為提取蝦殼中甲殼素的良好溶劑。一般情況下，以離子液體為溶劑提取蝦殼中甲殼素的工藝流程如圖3所示。離子液體與蝦殼粉按照一定比例混合后，在適當(dāng)加熱溫度和攪拌時(shí)間處理下能夠溶解礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和甲殼素，向混合體系加入反溶劑(水等[28,32])后，甲殼素可沉淀出來(lái)，而礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)則溶解在離子液體廢水溶液中被有效脫除。表2總結(jié)了不同提取溶劑、提取溫度和時(shí)間、固液比等條件下甲殼素的得率和純度。

圖2 離子液體溶解甲殼素的結(jié)構(gòu)模型

圖3 離子液體提取蝦殼中甲殼素的工藝流程圖

2.1 離子液體種類(lèi)的影響

對(duì)甲殼素有較好溶解能力的離子液體也顯示出良好的甲殼素提取效果，如利用[Emim]Ac從蝦殼中提取甲殼素得率為16.2%[36]；而[Amim]Cl對(duì)甲殼素的溶解度較低(0.5%)[25]，相對(duì)應(yīng)地得到的甲殼素僅為1.57%[37]。利用成本較低的銨基類(lèi)離子液體溶解蝦殼可以獲得與咪唑類(lèi)離子液體相當(dāng)?shù)募讱に禺a(chǎn)量和純度。例如，[NH3OH]Ac獲得的甲殼素純度>80%[30]。呂興梅等[32]利用一種季銨鹽類(lèi)離子液體一步脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，獲得甲殼素的純度>85%。由表2可知，含Ac-的離子液體對(duì)甲殼素的提取率比Cl-和P-都高，另外咪唑類(lèi)離子液體[Emim]Ac比銨基類(lèi)離子液體[DIPEA]Ac、[DMBA]Ac具有更高的甲殼素提取率。

表2 不同溶解條件下甲殼素得率和純度的比較?

? [Emim]DMP指1-乙基-3-甲基咪唑磷酸三甲酯；“-”表示參考文獻(xiàn)中未指出或未測(cè)定。

2.2 提取溫度和時(shí)間的影響

離子液體的黏度大小主要由氫鍵能和范德華力大小決定[41]，溫度對(duì)離子液體的黏度影響很大，大多數(shù)離子液體的黏度隨溫度的升高而急劇下降，從而影響分子的傳質(zhì)速度和溶解性[42]。Setoguchi等[43]以[Amim]Br為溶劑從蟹殼中提取甲殼素，發(fā)現(xiàn)得率隨溫度的升高而增大，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。周雅文等[37]指出蝦殼在離子液體[Amim]Cl中的溶解度隨溫度的升高先增大后下降，且隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。過(guò)高的溫度和過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蝦殼中有機(jī)成分的降解，離子液體黏度增加，從而不利于甲殼素的提取。由表2 可知，甲殼素的提取通常需要在較高的溫度條件下(100～110 ℃)，與銨基類(lèi)離子液體相比，咪唑類(lèi)離子液體提取甲殼素需要的時(shí)間較短(約為1 h)。

2.3 提取體系固液比的影響

傳統(tǒng)酸堿法顯示蝦殼的脫礦程度受固液比影響，在1∶3～1∶12(g/mL)固液比范圍內(nèi)，隨固液比的增大蝦殼脫礦率增加[34]。固液比通過(guò)影響溶質(zhì)與溶劑間的相互滲透作用而影響蝦殼在離子液體中的溶解。高靜等[35]發(fā)現(xiàn)1∶5～1∶25(g/mL)固液比范圍內(nèi)，蝦殼在[Emim]Ac中的溶解度隨固液比的增大而逐漸增加。一般情況下甲殼素的提取體系選擇固液比在1∶20～1∶25(g/mL)的提取效果最佳。

3 甲殼素提取物的化學(xué)組成分析

甲殼動(dòng)物的外骨骼是由一個(gè)3層的角質(zhì)層構(gòu)成的，內(nèi)層由甲殼素與蛋白質(zhì)包裹組成，甲殼素與礦物質(zhì)一起組成中間層，而外層則由碳酸鈣與蛋白質(zhì)組成[44]。其中甲殼素—蛋白纖維是由大約10～20個(gè)被蛋白質(zhì)包裹的甲殼素反平行鏈組成[45]。離子液體及含離子液體的多元體系具有溶解蛋白質(zhì)、甲殼素和灰分的能力[40,46]，所以甲殼素提取物中可能含有蛋白質(zhì)、碳酸鈣等雜質(zhì)。通常使用灰分測(cè)定法、凱氏定氮法、氨基酸分析法及元素分析法對(duì)甲殼素提取物的化學(xué)組成進(jìn)行分析鑒定[35,47-48]。

3.1 碳酸鈣的脫除率

蝦殼中礦物質(zhì)的含量是影響甲殼素溶解能力的重要因素[49]，蝦殼中的礦物質(zhì)主要是碳酸鈣，傳統(tǒng)酸法處理可有效去除蝦殼中的礦物質(zhì)成分，脫礦率高達(dá)90%以上[50-51]，如Younes等[50]報(bào)道的0.5 mol/L鹽酸對(duì)蝦殼的礦物質(zhì)脫除率達(dá)100%。離子液體主要通過(guò)陰、陽(yáng)離子與碳酸鈣的相互作用而實(shí)現(xiàn)蝦殼的脫礦過(guò)程。在反應(yīng)溫度100 ℃、時(shí)間1 h時(shí)，蝦殼經(jīng)過(guò)[Emim]Ac處理后礦物質(zhì)脫除率最高僅為42.84%[35]。而110 ℃溫度條件下，蝦殼在[DIPEA]P中反應(yīng)時(shí)間超過(guò)18 h后脫鈣率可達(dá)100%[38]。離子液體對(duì)蝦殼的脫礦效果的不同可能與離子液體種類(lèi)、作用溫度和作用時(shí)間等多種因素有關(guān)。

3.2 蛋白質(zhì)的脫除率

蝦殼溶解過(guò)程中，離子液體的陰、陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)的氨基酸形成強(qiáng)的氫鍵作用，從而使甲殼素—蛋白纖維的氫鍵斷裂[52]。傳統(tǒng)脫蛋白常用堿法和酶法，脫除率可達(dá)90%以上[53-54]。當(dāng)反應(yīng)溫度120 ℃，時(shí)間8 h時(shí)，[Emim]Ac對(duì)蝦殼中蛋白質(zhì)脫除率為67.13%[35]。相較而言，銨基類(lèi)離子液體([DIPEA]Ac、[DIPEA]P、[DMBA]Ac)處理30 h后提取的甲殼素中不含Ca元素，N元素<1.1%，具有良好的脫除礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的能力[38]。這可能與提取的時(shí)間有關(guān)，雖然甲殼素能夠在短時(shí)間內(nèi)溶解于[Emim]Ac等離子液體，但是當(dāng)蝦殼在離子液體中溶解時(shí)間越長(zhǎng)，越利于蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的脫除，提取的甲殼素純度越高。

4 再生后甲殼素提取物的結(jié)構(gòu)表征

通常采用掃描電鏡(SEM)、X-射線衍射(XRD)、紅外光譜分析(FT-IR)和熱重分析(TGA)等技術(shù)對(duì)再生后甲殼素提取物的表觀形貌、結(jié)晶度、分子結(jié)構(gòu)和熱性能進(jìn)行測(cè)定與鑒定[38,55-57]。

4.1 表觀形貌分析

市售甲殼素表面為一種粗糙而致密的層狀結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)酸堿法提取的甲殼素呈現(xiàn)多孔和纖維的表觀形貌[55]。根據(jù)報(bào)道[35,38]，利用離子液體從蝦殼中獲得的甲殼素提取物表面呈現(xiàn)魚(yú)鱗狀、多孔，而且出現(xiàn)黏附的絲狀纖維。而甲殼素直接在離子液體中溶解，再生甲殼素的表面不僅孔隙率增加，而且甲殼素樣品顆粒結(jié)構(gòu)也有所變化，如經(jīng)[Emim]Cl和[Bmim]Cl再生的甲殼素樣品的平均粒徑減小[27,56]。這些形貌的改變主要源于礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的脫除。

4.2 分子結(jié)構(gòu)表征

α-甲殼素在1 660，1 627 cm-1FTIR光譜處有明顯的兩個(gè)吸收帶，而β-甲殼素只在1 656 cm-1處有一條吸收帶[57]。周雅文等[37]發(fā)現(xiàn)蝦殼溶解再生物的紅外吸收在1 650，1 555 cm-1的酰胺振動(dòng)帶有明顯的吸收波長(zhǎng)。另外，Tolesa等[38]通過(guò)對(duì)比了市售甲殼素與離子液體提取的甲殼素的紅外吸收?qǐng)D譜，發(fā)現(xiàn)甲殼素提取物在1 660，1 560，1 312 cm-1處均有明顯的吸收波長(zhǎng)。說(shuō)明了利用離子液體提取的甲殼素含有酰胺基(—NHCOCH3)，具有與α-甲殼素類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)。

4.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

Li等[58]指出經(jīng)離子液體預(yù)處理后，甲殼素的結(jié)晶度降低了25%。圖4為[Emim]Ac溶解處理前后蝦殼的XRD比較圖，與未處理蝦殼對(duì)比，經(jīng)過(guò)離子液體處理后的再生甲殼素結(jié)晶度最低可降至58.7%[35]。還有研究[38]指出，與市售甲殼素相比[DIPEA]Ac、[DIPEA]P和[DMBA]Ac提取蝦殼中的甲殼素結(jié)晶度分別降低55%，46%，45%。根據(jù)結(jié)構(gòu)圖的峰高和峰寬可直接判斷看出物質(zhì)的結(jié)晶度變化，與蝦殼原料相比，離子液體提取的甲殼素的結(jié)晶度下降，因?yàn)殡x子液體去除了蝦殼中的礦物質(zhì)[35,38]。

4.4 熱穩(wěn)定性分析

甲殼素的質(zhì)量損失通常分為兩步，第一步是甲殼素結(jié)構(gòu)中的水分蒸發(fā)，第二步是多糖環(huán)的脫水、甲殼素的乙?；兔撘阴；木酆蟍59-60]。Setoguchi等[43]研究結(jié)果表明利用離子液體提取的蟹殼中的甲殼素與市售甲殼素的TGA曲線幾乎一致。類(lèi)似地，如圖5所示，Tolesa等[38]發(fā)現(xiàn)甲殼素的TGA曲線與市售甲殼素的TGA曲線基本吻合，說(shuō)明二者具有相似的熱穩(wěn)定性，有利于提取的甲殼素在抗熱材料中的應(yīng)用。對(duì)比圖4和圖5發(fā)現(xiàn)，離子液體提取的甲殼素結(jié)晶度的降低導(dǎo)致了甲殼素第二步質(zhì)量損失的起始溫度下降，說(shuō)明利用離子液體提取甲殼素會(huì)對(duì)其熱穩(wěn)定性有一定的影響。

圖4 [Emim]Ac溶解處理前后蝦殼XRD圖

圖5 再生甲殼素的TGA圖

5 展望

離子液體溶解蝦殼提取甲殼素的能力與傳統(tǒng)酸堿法相當(dāng)，可作為傳統(tǒng)酸堿試劑的良好替代品。近年來(lái)，利用離子液體提取蝦殼中甲殼素的研究不再局限于咪唑類(lèi)離子液體，其他一些離子液體也逐漸被發(fā)掘。但是，離子液體黏度大的特點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了其與蝦殼之間的傳質(zhì)作用，降低了甲殼素的提取率。離子液體的低毒特性和昂貴的價(jià)格，也極大地限制了其使用。因此，在提高甲殼素提取率和純度的同時(shí)，可尋找一些其他試劑替代部分離子液體以降低其黏度和生產(chǎn)成本。另外，天然無(wú)毒離子液體的合成和加強(qiáng)離子液體循環(huán)利用是未來(lái)的研究需要進(jìn)一步關(guān)注的問(wèn)題。