羅漢果黃酮的提取、純化及生物活性研究進(jìn)展

邵 佩 莊 虎 蹇順華 陳 勝

(1.武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040)

羅漢果果實(shí)呈卵形、橢圓形或球形，表面褐色、黃褐色或綠褐色，有深色斑塊及黃色柔毛，屬于中國(guó)廣西、湖南等熱帶、亞熱帶地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)和藥用植物[1]。羅漢果味甘性涼，被譽(yù)為“神仙果”，具有止咳祛痰[2]、降血糖[3]、抑菌[4-5]、保肝[2]、抗腫瘤[6-7]等多種功能活性，且羅漢果葉可用于治療皮炎、慢性心絞痛、慢性支氣管炎[8]、咳嗽、咽喉痛和便秘[2]，是首批被國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食兩用物品[9]。羅漢果中各種營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)研究[5]早于1980年；1987年，羅漢果被中國(guó)衛(wèi)生部列為雙生食用品種[10]，后又因其濃郁的甜味而聞名于世，是一種非熱量的天然甜味劑。

羅漢果果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含多糖[11]、黃酮[12-13]、維生素、蛋白質(zhì)及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。黃酮是羅漢果的天然有效活性成分之一，其果實(shí)中含量較高，達(dá)5～10 mg/個(gè)[14-15]。目前已有大量關(guān)于羅漢果中化學(xué)成分的研究，如多糖提取[16]、黃酮提取[15]，并取得了一定的成效，但缺乏對(duì)某單一活性成分研究的系統(tǒng)歸納與總結(jié)。文章擬對(duì)羅漢果黃酮的提取、純化、結(jié)構(gòu)及生物活性研究進(jìn)行系統(tǒng)整理與概括，并對(duì)羅漢果黃酮的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，以期進(jìn)一步推動(dòng)羅漢果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 羅漢果黃酮的提取與純化

1.1 提取

羅漢果黃酮的制備通常是先將羅漢果干燥、粉碎，然后采取不同的提取方法對(duì)黃酮進(jìn)行分離提取，上清液經(jīng)過濾濃縮、干燥后得羅漢果粗黃酮。

1.1.1 回流提取法 羅漢果黃酮的提取多采用回流提取法。梁英等[17]采用熱水回流提取法，得到羅漢果葉黃酮的最佳提取工藝為水煮沸提取50 min，料液比1∶30(g/mL)，提取3次，黃酮提取量為13.18 mg/g；楊洋等[18]采用乙醇回流提取法，得到最佳黃酮提取工藝為料液比1∶15(g/mL)，乙醇濃度70%，回流提取時(shí)間2 h，提取溫度70 ℃，黃酮得率為0.58%；崔彬[19]采取回流提取法，當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時(shí)，用80%乙醇于80 ℃下提取1 h，黃酮提取率最高，為1.52%；張海全等[20]采用回流提取法，得到羅漢果黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度88%，料液比1∶27(g/mL)，提取時(shí)間118 min，提取溫度80 ℃，此時(shí)黃酮得率為5.62 mg/g。

綜上，影響羅漢果黃酮提取率的因素主要有提取溫度、料液比、提取時(shí)間、回流次數(shù)及提取液濃度。與其他提取方法相比，回流提取法簡(jiǎn)單易于操作，安全環(huán)保，因而被廣泛使用，但也存在提取耗時(shí)較長(zhǎng)，所含雜質(zhì)高，產(chǎn)品純度不高，提取率低等問題。

1.1.2 輔助提取法 由于回流提取法的局限性，引入了一些新的提取技術(shù)，如超聲輔助提取法、微波輔助提取法等。

(1)超聲輔助提取法：通過利用超聲波的空化作用破壞待提取物細(xì)胞，使其中有效成分釋放出來(lái)，進(jìn)而擴(kuò)散到溶劑中，提高提取率的過程。容元平等[21]采用超聲波輔助提取羅漢果黃酮，研究得出最佳提取工藝為料液比1∶25(g/mL)，提取溫度70 ℃，乙醇濃度40%，提取時(shí)間40 min，此時(shí)黃酮得率為1.76%；同上工藝條件下采用二次逆流提取，黃酮得率為1.89%。何凱霞等[22]采用超聲波輔助法提取羅漢果果實(shí)黃酮，當(dāng)超聲功率250 W，乙醇濃度30%，料液比1∶9(g/mL)，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間40 min時(shí)，黃酮提取率最高，為2.86%。盧鳳來(lái)等[23]以羅漢果莖葉為原料，采用超聲輔助提取法,通過響應(yīng)面分析法得到最佳提取工藝為料液比1∶38(g/mL)，乙醇濃度80%，提取時(shí)間104 min，黃酮提取率為4.01%。張卓睿等[24]采用超聲波法提取羅漢果花黃酮，得到最佳提取工藝為料液比1∶15(g/mL)，超聲功率208.48 W，乙醇濃度67.55%，提取時(shí)間43.62 min，黃酮提取率為6.54%。

綜上，超聲輔助提取法提取羅漢果黃酮的工藝參數(shù)不同，其提取率也不同，可能與羅漢果果實(shí)來(lái)源、產(chǎn)地、生長(zhǎng)期、成熟度以及果實(shí)部位等因素相關(guān)。與回流提取法相比，超聲輔助提取法縮短了提取時(shí)間；當(dāng)超聲功率升高，黃酮提取率提高，但超聲功率過高會(huì)導(dǎo)致提取溫度升高，進(jìn)而影響黃酮的擴(kuò)散，降低提取率。當(dāng)采用超聲輔助提取法時(shí)，應(yīng)選擇合適的超聲功率與超聲時(shí)間以控制體系溫度，提高黃酮提取率。超聲輔助提取法具有效率高、提取時(shí)間短、適用范圍廣泛，適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些急需解決的問題，如超聲過程中噪聲較大，容易使液體溫度升高，需采取相應(yīng)的降溫操作等。

(2)微波輔助提取法：利用偶極子和傳導(dǎo)對(duì)待提取物進(jìn)行加熱，使其結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生變化，有效成分溶出，從而提高提取率的過程。秦滿發(fā)等[25]采用微波輔助法提取羅漢果黃酮，當(dāng)料液比為1∶35(g/mL)，羅漢果粒度40目，乙醇濃度50%，微波功率650 W，提取時(shí)間25 min時(shí)，提取率最高，為1.72%，且高于回流提取法的(1.61%)。

由表1可知，微波功率與羅漢果粒度可影響黃酮提取率，與回流提取法和超聲輔助提取法相比，微波輔助提取能顯著縮短提取時(shí)間，其主要原因是微波處理能改變或破壞羅漢果細(xì)胞，使黃酮大量溶出，且隨著微波功率的增強(qiáng)，其提取率不斷提高；但微波功率過高會(huì)導(dǎo)致微波溫度較高，進(jìn)而影響黃酮溶出，降低提取率。因此，運(yùn)用微波輔助提取法時(shí)，應(yīng)選擇合適的微波功率和微波時(shí)間。該法具有提取率高、操作簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少且環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[26]，但該法研發(fā)技術(shù)還不夠成熟，不宜用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。

表1 羅漢果黃酮不同提取法工藝參數(shù)對(duì)比?

? NA.示文中未提及；a.黃酮提取量，mg/g；b.黃酮得率，%。

1.2 純化

羅漢果的純化大多采用大孔樹脂法，崔彬[19]研究得到羅漢果粗黃酮的最佳純化工藝為上樣濃度2.50 mg/mL，上樣流速2 BV/h，pH 4，用50%乙醇以1.50 BV/h流速洗脫，羅漢果黃酮純度為39.70%，進(jìn)一步純化后得精制羅漢果黃酮純度為81.70%。梁英等[17]研究得到精制黃酮產(chǎn)品，其含量為13.18 mg/g。陳全斌等[27]采用熱水回流法提取羅漢果黃酮，提取物以硅膠G為吸附劑，以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水=53∶30∶10∶10為展開劑，采用柱層析法進(jìn)行純化分離羅漢果精制黃酮，得化合物I、II，純度分別為99.00%，98.50%。

綜上，大孔樹脂法純化得到的黃酮純度與樹脂種類、上樣濃度、pH、流速、洗脫液濃度等因素有關(guān)。大孔樹脂法純化是通過利用其吸附功能達(dá)到對(duì)黃酮的分離純化，除去色素、果膠等雜質(zhì)，能顯著提高羅漢果黃酮純度。該法具有操作簡(jiǎn)單、選擇性好、吸附強(qiáng)、使用周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛使用。

2 羅漢果黃酮結(jié)構(gòu)

黃酮類化合物是植物的次生代謝產(chǎn)物，是天然酚類物質(zhì)中分布最廣泛的天然化合物之一。黃酮類化合物被認(rèn)為是以C6-C3-C6碳骨架為特征的化合物，其中C6組分為芳香C環(huán)和C3雜環(huán)[28-29]，類黃酮的分類是基于雜環(huán)C3的變化。目前黃酮類化合物主要分為兩大類，即類黃酮和異黃酮，第一類是基于1,3-二苯基丙烷的C6-C3-C6為骨架，第二類是基于1,2-二苯基丙烷為骨架[28]。

羅漢果黃酮結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析一般包括紅外特征吸收峰的分析、組成成分分析及黃酮連接方式的鑒定等，目前關(guān)于羅漢果結(jié)構(gòu)的研究較少且不夠深入。羅漢果果實(shí)不同部位提取的黃酮具有不同的結(jié)構(gòu)，各部位對(duì)應(yīng)的黃酮結(jié)構(gòu)及其分析方法見表2。

表2 羅漢果各部位對(duì)應(yīng)的黃酮結(jié)構(gòu)及其分析方法

3 羅漢果黃酮的生物活性

體外和動(dòng)物試驗(yàn)研究[28]表明，黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗過敏、保肝等活性作用。目前對(duì)羅漢果黃酮生物活性的研究主要集中在抗氧化、抑菌、降血糖等方面。

3.1 抗氧化能力

羅漢果黃酮因含有大量的酚羥基基團(tuán)而具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這些基團(tuán)通過清除活性氧和自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化能力。目前已有大量關(guān)于羅漢果不同部位提取物抗氧化活性的相關(guān)研究，陳全斌等[38]研究發(fā)現(xiàn)羅漢果葉黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性，且為丁基羥基甲苯(BHT)的4倍。梁英等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羅漢果葉黃酮濃度為1.00 mg/mL 時(shí)，自由基清除能力最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)100%，對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)88.90%，且其清除自由基的能力顯著高于BHT(P<0.05)，表明羅漢果葉黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。藍(lán)群等[39]發(fā)現(xiàn)當(dāng)羅漢果塊根黃酮濃度為4.00 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力及總還原能力最大，分別為VC的75.77%，81.59%；濃度為3.00 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力最大，分別為VC的75.04%，88.19%，表明羅漢果塊根黃酮具有抗氧化活性。黃歡等[40]研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果黃酮DPPH清除率和IC50均低于陽(yáng)性對(duì)照，但仍具有抗氧化能力。莫凌凌等[32]通過FRAP、TEAC和ORAC試驗(yàn)表明從羅漢果花中分離出的5種黃酮類化合物有顯著的抗氧化活性。Pan等[33]發(fā)現(xiàn)羅漢果葉粗提物(SEE)具有類似于BHT的抗氧化活性，且SEE的黃酮含量相當(dāng)于83.45 g/kg 兒茶素提取物。

3.2 抑菌活性

據(jù)報(bào)道[41-42]，黃酮類化合物對(duì)多種病原菌均具有抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌等微生物。羅漢果黃酮的抑菌能力與其含有的酚羥基有關(guān)，酚羥基可螯合影響細(xì)菌細(xì)胞外膜穩(wěn)定的離子，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成結(jié)構(gòu)或功能損害，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝來(lái)抑制其繁殖。Ahmad等[43]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物分子中含有苯環(huán)和羥基，能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，破壞質(zhì)膜，抑制核酸的合成。張海全等[20]研究表明羅漢果黃酮對(duì)細(xì)菌和真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，其抑菌活性大小為真菌>G+>G-；且羅漢果黃酮對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.25 g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的MIC為0.13 g/mL，對(duì)白色念珠菌、黑曲霉的MIC為0.06 g/mL。何凱霞等[22]研究顯示，羅漢果黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念球菌、產(chǎn)氣桿菌和藤黃八疊球菌4種革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑制作用，對(duì)枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌的MIC為5×10-5g/mL，對(duì)藤黃八疊球菌和白色念球菌的MIC為5×10-4g/mL。藍(lán)群等[39]發(fā)現(xiàn)：羅漢果塊根粗提液濃度為4.00 mg/mL 時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢桿菌、根霉和曲霉均有抑菌效果。

3.3 降血糖作用

目前有研究發(fā)現(xiàn)羅漢果中黃酮具有降血糖作用，饒榮[44]研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果果實(shí)、莖葉黃酮提取物治療鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠時(shí)能明顯改善其體重，降低空腹血糖值，與陽(yáng)性對(duì)照相比，其空腹血糖值無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且莖葉黃酮的降血糖作用明顯優(yōu)于果實(shí)黃酮的(P<0.05)。鄭楚等[3]研究表明，羅漢果黃酮對(duì)STZ糖尿病鼠具有顯著的降血糖作用(P<0.05)，當(dāng)羅漢果中黃酮含量為80 mg/kg時(shí)，能極顯著降低糖尿病大鼠血糖水平(P<0.01)，顯著降低糖尿病大鼠血脂、丙二醛(MDA)水平(P<0.05)，顯著增高超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、糖尿病大鼠胰島素水平(P<0.05)，表明羅漢果黃酮可改善由STZ引起的病理學(xué)改變，有益于緩解糖尿病大鼠的癥狀，對(duì)糖尿病并發(fā)癥有良好的防治作用，且羅漢果黃酮含量與降血糖作用呈量效關(guān)系。羅漢果黃酮可降低血清MDA，提高SOD、GSH-Px活力，抗氧化能力是降血糖作用的機(jī)制之一。

3.4 其他生物活性

羅漢果黃酮除具有抗氧化、抑菌和降血糖的生物活性外，還具有抗衰竭[45]、防治動(dòng)脈粥樣硬化[46]、保肝[36]等作用。陳梅[45]研究發(fā)現(xiàn)，在飲食羅漢果葉制備的黃酮后，大鼠的耐力訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，表明羅漢果葉黃酮可顯著提高大鼠的抗疲勞能力(P<0.05)。王程強(qiáng)等[46]研究發(fā)現(xiàn)羅漢果葉黃酮能保護(hù)菲咯啉銅誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，能有效防治動(dòng)脈粥樣硬化。

4 展望

羅漢果具有較強(qiáng)的保健功效，目前其研究主要集中在羅漢果黃酮提取、純化、抗氧化、抑菌、降血糖等方面。后續(xù)對(duì)羅漢果黃酮的研究可以從以下兩方面進(jìn)行：① 加強(qiáng)對(duì)羅漢果黃酮結(jié)構(gòu)的深入研究，探究羅漢果黃酮的結(jié)構(gòu)成分與其生物活性的構(gòu)效關(guān)系；② 加強(qiáng)對(duì)羅漢果黃酮的抗癌活性研究，并進(jìn)行毒理學(xué)及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。