不同貯藏條件下雞胸肉特征腐敗菌分析

張 莉 尹德鳳 張大文 羅林廣

(1.江西省農業(yè)科學院農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2.農業(yè)部畜禽產品質量安全風險評估實驗室〔南昌〕，江西 南昌 330200；3.江西省農科院農產品質量與安全重點實驗室，江西 南昌 330200)

雞肉肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，是中國的主要消費肉類之一[1]。近年來，雞肉的消費量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。為了抑制禽類疾病，尤其是禽流感的傳播，國家推行禽類集中屠宰，冷鏈配送，冷鮮上市。但是，由于冷鮮雞肉從屠宰、加工、運輸、銷售到消費鏈條較長，各環(huán)節(jié)中微生物的污染不可避免，一旦整個鏈條中溫度控制不嚴，時間過長，微生物將會大量繁殖，加快肉品腐敗變質。這些直接導致肉品腐敗變質的微生物即為腐敗菌(spoilage organisms，SO)[2]。

已有的研究[2-3]表明，腐敗菌并不單獨引發(fā)腐敗，通常是與其他微生物不斷地相互競爭或協(xié)同作用影響著產品的腐敗進程。因此，研究肉品表面微生物多樣性變化，是探索肉品腐敗變質誘因的主要途徑和手段。但是由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術分離效率低，時間長，過程繁雜，且絕大多數微生物是不可培養(yǎng)的，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術只能獲得不到1%的微生物種類，無法有效地對腐敗過程中的細菌多樣性進行完整分析[4]。而基于16S rRNA的高通量測序方法可以獲得樣品中更多的DNA信息，具有更快捷，通量高，重復性好，精確度高的優(yōu)點，在食品微生物多樣性的研究中得到了廣泛的應用。譬如，Ercolini等[5]采用16S rRNA的高通量測序方法對不同包裝形式下牛肉中腐敗微生物變化規(guī)律進行了調查，結果顯示不同包裝條件下牛肉中的優(yōu)勢腐敗微生物截然不同。De Filippis等[6]通過高通量技術手段，發(fā)現(xiàn)不同切割部位的牛肉腐敗微生物的組成是不盡相同的。Meng等[7]通過Miseq高通量測序技術對不同溫度保存下的禽產品中微生物多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)溫度顯著影響雞肉表面細菌多樣性和優(yōu)勢腐敗菌的組成。上述結果表明，產品中腐敗菌(special spoilage organisms，SSO)因肉品的種類、來源、屠宰方式、分割部位、保鮮包裝條件和儲存運輸條件等不同而存在差異。

試驗擬以寧都黃雞新鮮雞胸肉為研究對象，分析測定不同貯藏條件(4 ℃真空包裝、4 ℃有氧托盤包裝和25 ℃ 有氧托盤包裝)下生鮮雞肉的菌落總數和揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)值，以期闡明不同貯藏條件下雞胸肉理化指標和表面菌的多樣性變化規(guī)律，探尋其特征腐敗菌，為生鮮雞肉的貯藏保鮮技術研發(fā)提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

寧都黃雞：江西惠大實業(yè)有限公司；

無菌采樣袋：北京陸橋技術股份有限公司；

無菌真空包裝袋：得力集團有限公司；

聚乙烯保鮮膜：華潤超市。

1.2 試劑

平板計數瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、甲基紅指示劑等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器設備

生化培養(yǎng)箱：SPX-250BSH-II型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

真空包裝機：14885型，得力集團有限公司；

拍擊式均質器：BagMixer?400cc型，法國Interscience公司；

高速臺式冷凍離心機：Sorvall ST16R型，美國Thermo公司；

PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，美國應用生物系統(tǒng)公司；

電子天平：PL602E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 生鮮雞肉樣品制備參照文獻[8]的方法進行，活雞宰殺后拔毛清洗，胴體經次氯酸鈉溶液浸泡消毒(濃度50 mg/L)，無菌冷卻水沖洗，無菌操作取雞胸肉并切成小塊，最后將全部雞肉塊置于無菌采樣袋內顛倒數次混合均勻，立即置于冰水中預冷1 h。

1.4.2 樣品分裝貯藏與樣品采集

(1)4 ℃托盤貯藏：將聚苯乙烯托盤用75%酒精擦拭后，置于紫外燈下照射30 min進行消毒。將預冷后的雞胸肉分裝至已消毒的聚苯乙烯托盤中，每份60 g，共計21份，然后樣品表面用聚乙烯保鮮膜覆蓋，置于4 ℃溫度下貯藏，每天取樣1次，試驗周期為7 d[9]。

(2)4 ℃真空貯藏與樣品采集：將預冷后的雞胸肉分裝至無菌真空包裝袋中，每份60 g，共計33份，樣品經真空包裝后置于4 ℃溫度下貯藏，每天取樣1次，試驗周期為11 d[8]。

(3)25 ℃托盤貯藏與樣品采集：將預冷后的雞胸肉分裝至已消毒的聚苯乙烯托盤中，每份60 g，共計9份，然后樣品表面用聚乙烯保鮮膜覆蓋，置于25 ℃溫度下貯藏，每天取樣1次，試驗周期為3 d。

(4)雞肉表面微生物樣品處理：在各取樣時間點，稱取25 g樣品于無菌均質袋中，并加入225 mL無菌生理鹽水，置于均質器上適當拍擊后，取100 mL均質液于離心管中，300 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液轉移至50 mL 高速無菌離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用1 mL生理鹽水轉移至冷凍保藏管中，于-80 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 細菌總數測定 按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數》執(zhí)行。

1.4.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測定 按GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定 半微量定氮法》執(zhí)行。

1.4.5 微生物多樣性分析

(1)DNA提取及MiSeq測序：樣品中DNA提取參照Xu等[10]的方法進行，細菌16S rDNA V3-V4擴增引物為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。PCR反應體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL Forward Primer(5 μmol/L)、0.8 μL Reverse Primer(5 μmol/L)、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA，補ddH2O至20 μL。反應參數：① 95 ℃預變性3 min；② 27×(95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s)；③ 72 ℃延伸10 min，10 ℃保持。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，大小正確，條帶清晰可見的目標條帶用于進行后續(xù)測序試驗，MiSeq測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

(2)數據分析：使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的免費在線數據分析平臺——I-Sanger對數據進行分析(www.i-sanger.com)。

2 結果與分析

2.1 菌落總數的變化

如圖1所示，4 ℃托盤貯藏的雞胸肉在整個試驗期間呈現(xiàn)先降低再緩慢上升的趨勢，第7天菌落總數為(6.25±0.27)lg(CFU/g)；4 ℃真空貯藏的雞胸肉菌落總數呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢，第4天菌落總數達到峰值，為(4.78±0.07)lg(CFU/g)；25 ℃托盤貯藏的雞胸肉菌落總數呈現(xiàn)快速上升的趨勢，第2天菌落總數為(8.44±0.04)lg(CFU/g)。分析4 ℃下菌落總數出現(xiàn)波動的原因，可能是因為雞胸肉表面微生物結構復雜，許多嗜溫微生物并不能適應低溫環(huán)境，因此在4 ℃托盤貯藏和4 ℃真空貯藏初期均出現(xiàn)了菌落總數下降的現(xiàn)象，隨著許多耐低溫細菌的不斷生長繁殖，菌落總數又會慢慢回升，當4 ℃真空貯藏雞肉組織中殘存的氧分子不斷被消耗掉，好氧菌開始減少，導致真空冷藏后期菌落總數的再次回落。根據GB 16869─2005《鮮、凍禽產品》規(guī)定：鮮禽產品的菌落總數≤1×106CFU/g，可以看出，4 ℃ 托盤貯藏雞胸肉的菌落總數在第7天超過標準規(guī)定值，25 ℃托盤貯藏的第2天就已超過規(guī)定值，而4 ℃真空貯藏的試驗期間均在標準規(guī)定范圍內。

圖1 不同貯藏條件下雞胸肉菌落總數變化

Figure 1 Aerobic plate count of chicken breast during storage under different conditions

2.2 TVB-N值的變化

GB 2707─2016《食品安全國家標準鮮(凍)畜、禽產品》標準規(guī)定的TVB-N值限值為15 mg/100 g。由圖2可以看出，4 ℃托盤貯藏和4 ℃真空貯藏雞胸肉在整個試驗期間的TVB-N值變化較少，且低于標準限值，而25 ℃托盤貯藏的迅速上升，在第1天就已接近標準限值。

圖2 各貯藏條件下雞胸肉TVB-N值變化

2.3 雞胸肉表面細菌多樣性的變化

2.3.1 測序數據統(tǒng)計 對混勻分裝前的初始樣本進行了表面細菌多樣性分析，并根據雞胸肉樣本菌落總數值和TVB-N測定值，選擇4 ℃托盤貯藏第2天和第7天、4 ℃真空貯藏第2天和第11天以及25 ℃托盤貯藏第1天和第3天的樣本，進行雞胸肉表面細菌多樣性分析和比較。經拼接、過濾等數據前處理，7個樣本一共得到255 075條有效16S rRNA序列，平均長度為448.53 bp。按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行運算分類單元(OTU)聚類，得到OTU總數為504個。不同樣本的序列信息見表1。在不同貯藏條件下的OTU數，均為試驗前期的數值高于后期數值。樣本在分裝前于同一采樣袋中充分混勻，保證了各樣本初始狀態(tài)處于同一水平，分裝貯藏后，隨著貯藏時間的推移，各貯藏條件下的優(yōu)勢菌不斷生長，雞肉樣本中的OTU數隨之降低。4 ℃托盤貯藏保存后期比前期減少了近70.33%。25 ℃托盤貯藏儲存后期比前期減少了73.33%；與有氧貯藏環(huán)境相比，真空冷藏環(huán)境下貯藏后期雞肉表面細菌的OTU數與前期相比變化并不十分顯著，僅減少了10.76%。

2.3.2 稀釋曲線分析 為了驗證取樣數量的合理性，對樣品的稀釋曲線進行分析，如圖3所示，所有樣本的稀釋曲線均已趨向平坦，說明試驗取樣數量合理，測序深度已基本覆蓋樣本中所有微生物。

2.3.3 阿爾法多樣性分析 樣本表面細菌阿爾法多樣性結果采用豐富度指數chao1值、物種覆蓋度和香農多樣性指數值進行表示。如表2所示，不同貯藏條件的樣本物種覆蓋度均為1.00，說明試驗樣本中所含序列均被成功測序，該次測序結果可反映樣本中細菌群落結構的真實情況。4 ℃托盤貯藏的雞胸肉第7天表面細菌豐富度指數chao1值較第2天降低了38.47%，香農多樣性指數值降低了79.10%，說明該貯藏條件下，細菌豐富度和多樣性均隨著貯藏時間的增加而降低；4 ℃真空貯藏的雞胸肉第11天較第2天的豐富度指數chao1值上升了11.84%，香農多樣性指數值降低了43.86%，說明該貯藏條件下，細菌豐富度隨著貯藏時間的增加稍有上升，而多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。25 ℃托盤貯藏的雞胸肉第1天較第3天豐富度指數chao1值降低了81.67%，香農多樣性指數值降低了7.49%，說明該貯藏條件下，細菌豐富度隨著貯藏時間的增加急劇下降，而多樣性稍有降低。

表1 樣本序列信息統(tǒng)計表?

? ND_0為分裝前的初始樣本；4A_2、4A_7分別為4 ℃托盤貯藏第2天和第7天的樣本；4V_2、4V_11分別為4 ℃ 真空貯藏第2天和第11天的樣品；25A_1、25A_3分別為25 ℃托盤貯藏第1天和第3天的樣本。

ND_0.分裝前的初始樣本 4A_2.4 ℃托盤貯藏第2天的樣本 4A_7.4 ℃托盤貯藏第7天的樣本 4V_2.4 ℃真空貯藏第2天的樣品 4V_11.4 ℃真空貯藏第11天的樣品 25A_1.25 ℃托盤貯藏第1天的樣本 25A_3.25 ℃托盤貯藏第3天的樣本

圖3 稀釋性曲線圖

Figure 3 Rarefaction curves

2.3.4 物種群落結構特征 雞胸肉樣本表面細菌群落結構變化如圖4所示。變形菌門(Proteobacteria)在所有樣本中的相對豐度最大，初始樣本中相對豐度為85.48%，4 ℃ 托盤貯藏的第2天變形菌門占94.16%，第7天(菌落總數已超標)為99.58%；25 ℃托盤貯藏的第1天變形菌門占86.70%，第3天(嚴重腐敗)為93.08%；而4 ℃真空貯藏的第2天變形菌門相對豐度下降為66.14%，第11天又回升至83.66%，但仍低于初始樣本的85.48%[圖4(a)]，而此時的雞胸肉相關理化指標仍保持在新鮮雞肉允許范圍內，樣品未發(fā)生腐敗變質。

表2 樣本表面細菌阿爾法多樣性指數分析?

? ND_0為分裝前的初始樣本；4A_2、4A_7分別為4 ℃托盤貯藏第2天和第7天的樣本；4V_2、4V_11分別為4 ℃真空貯藏第2天和第11天的樣品；25A_1、25A_3分別為25 ℃托盤貯藏第1天和第3天的樣本。

從屬水平上分析，初始樣本中以假單胞菌屬細菌為主，豐度約65.82%，另外短波單胞菌屬細菌的豐度約為9.85%，寡養(yǎng)單胞菌屬細菌的豐度約4.63%，金黃桿菌屬細菌的豐度約3.60%，漫游球菌屬細菌的豐度約3.51%，鞘氨醇桿菌屬細菌的豐度約2.68%，假蒼白桿菌細菌的豐度約1.48%，產堿菌細菌的豐度約1.29%。從圖4(b)可以看出，雞胸肉在4 ℃和25 ℃溫度下采用真空和托盤包裝貯藏，從貯藏初期開始各條件下的雞肉表面細菌結構就已開始發(fā)生明顯變化。

不同貯藏條件下雞胸肉表面細菌群落結構與初始樣本比較，相對豐度變化較大的物種包括：假單胞菌屬、腸桿菌科未分類屬、志賀氏菌屬、乳桿菌屬、沙雷氏菌屬、泛菌屬、葡萄球菌屬、歐文氏菌屬、腸球菌屬、芽胞桿菌屬等。

25A_1.25 ℃托盤貯藏第1天的樣本 25A_3.25 ℃托盤貯藏第3天的樣本 4A_2.4 ℃托盤貯藏第2天的樣本 4A_7.4 ℃托盤貯藏第7天的樣本 4V_2.4 ℃真空貯藏第2天的樣品 4V_11.4 ℃真空貯藏第11天的樣品 ND_0.分裝前的初始樣本

圖4 雞胸肉表面細菌的物種群落柱形圖

Figure 4 Profiling histogram of bacteria on the surface of chicken breast

假單胞菌屬細菌在初始樣本中的豐度為65.82%，在不同條件的貯藏前期假單胞菌屬細菌豐度均有所下降，4 ℃ 托盤貯藏和4 ℃真空貯藏的第2天分別降至59.87% 和35.50%，25 ℃托盤貯藏的第1天降為54.64%。在試驗結束時，4 ℃托盤貯藏和4 ℃真空貯藏樣本的豐度又有不同程度的回升，4 ℃托盤貯藏第7天回升至99.45%，4 ℃ 真空貯藏第11天回升至81.08%，分別比初始樣本提高了51.09%和23.18%；而在25 ℃托盤貯藏試驗結束時，假單胞菌屬細菌豐度為60.23%，比初始樣本65.82%略有下降。

通過分析，4 ℃托盤貯藏時，雞胸肉產品中的特征腐敗微生物是假單胞菌，與Wang等[11]、高磊等[12]、Arnaut-Rollier等[13]的研究結果一致。雖然這些試驗所用的雞肉品種、來源、取樣部位以及加工環(huán)境都不同，且樣本的初始菌相也不盡相同，但4 ℃托盤貯藏的雞肉樣本在貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌都指向假單胞菌。說明采用4 ℃托盤貯藏生鮮雞肉的特征腐敗菌并不受雞肉品種、來源和雞肉部位的影響，因此，要延緩該貯藏條件下冷鮮雞肉的腐敗進程，延長貨架期，控制假單胞菌屬細菌的生長是重要手段之一。在4 ℃真空貯藏條件下，假單胞菌屬細菌也在很大程度上決定了該貯藏條件下雞胸肉的腐敗進程，是該條件包裝產品的主要特征腐敗細菌之一，與Rossaint等[14]、Herbert等[15]、Holl等[16]的研究結果一致。腸桿菌科細菌中，相對豐度的主要變化來源于志賀氏菌屬、腸桿菌科未分類屬、沙雷氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬等。在初始樣本中除了腸桿菌科未分類屬細菌豐度為0.90%外，其余腸桿菌科各屬細菌豐度<0.01%。4 ℃托盤貯藏的第2天，腸桿菌科未分類屬細菌豐度為14.18%，志賀氏菌屬細菌豐度為8.76%，沙雷氏菌屬細菌豐度為6.40%，泛菌屬細菌豐度為2.08%；4 ℃真空貯藏的第2天腸桿菌科未分類屬細菌豐度為11.78%，志賀氏菌屬細菌豐度為6.64%，沙雷氏菌屬細菌豐度為5.51%，泛菌屬細菌豐度為1.76%；25 ℃托盤貯藏的第1天，腸桿菌科未分類屬細菌豐度為5.49%，志賀氏菌屬細菌豐度為17.34%，沙雷氏菌屬細菌豐度為0.43%，泛菌屬細菌豐度為6.17%。4 ℃托盤貯藏的第7天，除腸桿菌科未分類屬細菌豐度為0.08%外，腸桿菌科其余各屬細菌豐度<0.01%；4 ℃真空貯藏的第11天除腸桿菌科未分類屬細菌豐度為1.30%外，腸桿菌科其余各屬細菌豐度<0.01%；25 ℃托盤貯藏的第3天，腸桿菌科未分類屬細菌豐度為14.49%，志賀氏菌屬細菌豐度為4.55%，沙雷氏菌屬細菌豐度為9.50%，泛菌屬細菌豐度為0.77%。

25 ℃托盤貯藏雞肉的腐敗菌多由腸桿菌科細菌組成，主要包括沙雷氏菌屬細菌、志賀氏菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、泛菌屬細菌，另外芽孢桿菌屬細菌、梭菌屬細菌、葡萄球菌屬細菌和腸球菌屬細菌也在該條件下發(fā)揮著腐敗協(xié)同作用，這些細菌都是嗜溫細菌，一旦溫度合適，會在短時間內快速繁殖，使雞肉發(fā)生腐敗。因此，冷鮮雞肉從生產加工到運輸和貯藏銷售的整個冷鏈系統(tǒng)必須完整并全程控溫，一旦溫度失控，即使是短時間失控，也會對整批產品造成無法挽回的損失。

乳桿菌屬細菌在初始樣本中的豐度僅為0.42%，但4 ℃ 真空貯藏的第2天高達12.03%，較初始樣本升高了約27.6倍，第11天豐度仍高達6.9%，較初始樣本升高了約15.4倍。托盤貯藏時，乳桿菌屬細菌也有少量生長，在4 ℃托盤貯藏的第2天豐度為0.85%，較初始樣本升高了約1倍，第7天降至0.06%，遠低于初始樣本；在25 ℃托盤貯藏的第1天豐度為3.97%，較初始樣本高了約8.4倍，第3天降至0.80%，但仍高于初始樣本。乳桿菌屬細菌在4 ℃真空貯藏的整個過程中豐度均比較高，在貯藏第2天和第11天乳桿菌屬細菌相對豐度均僅次于假單胞菌屬，因此在很多通過平板培養(yǎng)法或其他分析方法的研究[12,17-18]中很容易從樣品中分離獲得乳桿菌屬細菌信息。但要確定這些分離的乳酸菌在真空貯藏條件下發(fā)揮的確切作用，不能僅因為從腐敗樣品中分離或獲得了相關菌株信息，就將乳酸菌定義為該樣品的腐敗菌，必須通過回接測定其腐敗能力或進行相關的抑菌試驗等來進行判斷。

葡萄球菌屬細菌在初始樣本中豐度僅為0.16%，但4 ℃ 真空貯藏2 d后為3.67%，較初始樣本升高了約21.9倍，至第11天該屬細菌的豐度有所下降，為0.81%，但仍較初始樣本高；4 ℃托盤貯藏的第2天該屬細菌的豐度為0.25%，到第7天低于0.01%；25 ℃托盤貯藏1 d后，該屬細菌豐度為3.73%，較初始樣本升高了約22.3倍，第3天時又降為0.25%。

3 結論

試驗對4 ℃托盤貯藏、4 ℃真空貯藏和25 ℃托盤貯藏3種條件下生鮮雞肉的菌落總數和TVB-N值變化進行了測定，并根據該理化數值選取各貯藏條件下的前期與后期樣本，進行雞胸肉表面細菌多樣性分析。通過對前期與后期樣本表面細菌群落結構分析，發(fā)現(xiàn)嗜冷細菌假單胞菌為4 ℃托盤貯藏和4 ℃真空貯藏雞肉的共同特征腐敗菌。25 ℃托盤貯藏的特征腐敗菌由腸桿菌、芽孢桿菌、梭菌和腸球菌等組成。嗜溫細菌會在冷藏溫度失去控制的情況下，快速地在雞肉中生長使產品發(fā)生腐敗。因此，嗜冷細菌假單胞菌生長的控制和冷藏溫度的全程無縫監(jiān)控是冷鮮雞肉產業(yè)中需重點關注的兩個方面。而乳桿菌、腸桿菌、芽孢桿菌、腸球菌、明串珠菌、葡萄球菌以及梭菌等細菌在4 ℃低溫貯藏前期出現(xiàn)到底是參與腐敗加快進程作用，還是抑制腐敗延緩腐敗進程作用還有待進一步研究，特別是乳桿菌在真空包裝生鮮雞肉中的作用。但由于在設定的11 d貯藏期內，雞胸肉樣品各理化指標并沒有發(fā)展到腐敗變質的程度，沒有獲得4 ℃真空貯藏雞胸肉腐敗狀態(tài)下的細菌多樣性相關信息，因此有必要延長試驗周期，確保能獲得該貯藏條件下的腐敗樣品，進而分析判斷該貯藏條件下雞胸肉中的特征腐敗菌。