姜黃素對胃癌細胞增殖、遷移及Hsp90/JAK/STAT3通路的影響

李 磊，陳志武

胃癌發(fā)病率在我國各種惡性腫瘤中位居首位[1]。幽門螺旋桿菌感染、工作壓力增大以及生存環(huán)境改變等原因使患胃癌的人呈現(xiàn)年輕化趨勢。很多胃癌早期癥狀不明顯，造成胃癌早期診斷率低下[2]。目前胃癌的治療以手術(shù)切除為主，并輔助放化療治療，所以尋找高效的抗腫瘤藥物尤為重要。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療失敗的主要原因，有效控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療的關(guān)鍵。姜黃素具有抗腫瘤作用，可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段，且?guī)缀鯚o不良反應(yīng)[3-4]。美國食品藥品管理局已將其作為21世紀抗癌新藥[3-4]。該研究以胃癌SGC-7901細胞株為研究對象，探討姜黃素對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響及其分子機制，揭示了姜黃素對胃癌細胞的作用與作用靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料TRIzol試劑、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、CCK8均購自美國Thermo公司；Transwell小室購自美國Corning公司；姜黃素購自上海碧云天生物科技公司；一抗GAPDH、JAK、STAT3及二抗購自美國Abcam公司；胃癌細胞SGC-7901購自中科院上海細胞所。

1.2細胞培養(yǎng)及藥物處理首先將復(fù)蘇的胃癌細胞加入含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。當(dāng)細胞匯合度達90%左右時消化、傳代。將試驗細胞分為4組，每組按照1×104/ml的密度接種，并用不同濃度姜黃素(0、15、25、35 μmol/L)分別處理各組細胞并用于后續(xù)實驗。

1.3CCK8法檢測胃癌細胞增殖活性姜黃素處理受試細胞后，選取24 、48 h時間點的細胞，用含有10% CCK8的培養(yǎng)基對細胞進行換液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶標儀450 nm波長下測定四組受試細胞的吸光度(optical density，OD)值。

1.4Transwell實驗檢測胃癌細胞侵襲能力姜黃素處理(0、25、35 μmol/L)胃癌細胞24 h后，胰酶消化，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備細胞懸液，將細胞懸液加入小室上室，下室加入含有血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，保證每個小室內(nèi)接種的細胞數(shù)一致。把細胞板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去上室內(nèi)未穿膜的細胞后進行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機選取每個膜上的5個視野計數(shù)。

1.5劃痕實驗檢測胃癌細胞遷移能力用姜黃素處理(0、25、35 μmol/L)胃癌細胞24 h后，將細胞接種于細胞板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)一段時間。然后采用小槍頭在孔底做劃線處理，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗被劃下的細胞，加入新的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后進行拍照。

1.6細胞總RNA的提取及cDNA合成姜黃素處理胃癌細胞24 h后，將1 ml TRIzol加入每孔細胞中進行裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管，向每管加入200 μl氯仿并搖勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上層水相至新的EP管，加入500 μl異丙醇，室溫放置一段時間后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，所得白色沉淀即為RNA。用75%乙醇洗滌RNA 2次，自然晾干后將RNA溶解于DEPC水中。cDNA合成使用TAKARA的One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit，按照說明書指示進行逆轉(zhuǎn)錄操作。

1.7實時熒光定量PCR實驗實時熒光定量PCR實驗在ABI 7300 Real-Time PCR System儀器上按照One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TAKARA)說明書進行操作，反應(yīng)程序為：95 ℃、30 s，40個循環(huán)的95 ℃、5 s及 60 ℃、30 s。GAPDH作為內(nèi)參，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt表示。相關(guān)引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 qPCR引物列表

1.8Westernblot實驗姜黃素處理胃癌細胞24 h后，毎孔中加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)入EP管中。12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。每組取等量蛋白樣品加入適量SDS上樣緩沖液，混勻后置于100 ℃水浴鍋中加熱5 min，變性失活。然后進行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫孵育2 h，封閉完成后孵育一抗(稀釋比為1 ∶1 000)，4 ℃過夜。次日在室溫下孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，凝膠成像設(shè)備進行結(jié)果觀察并拍照，Image J軟件進行條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1姜黃素抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖活性姜黃素對胃癌細胞SGC-7901增殖活性的抑制效果見圖1。結(jié)果顯示：測試濃度(15～35 μmol/L)下的姜黃素作用24 h和48 h均能顯著抑制胃癌細胞株SGC-7901的增殖水平(P<0.05)，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，即隨著姜黃素濃度增大，抑制效果增強。

圖1 姜黃素對胃癌細胞SGC-7901細胞增殖活性的影響

2.2姜黃素抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲和遷移姜黃素影響胃癌細胞SGC-7901侵襲和遷移的實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，測試濃度(25、35μmol/L)的姜黃素對受試胃癌細胞的侵襲和遷移均產(chǎn)生了明顯抑制作用，且隨著姜黃素濃度增大，其抑制效果增強(P<0.05)。

圖2 姜黃素對胃癌細胞SGC-7901侵襲與遷移能力的影響

2.3姜黃素處理抑制胃癌細胞增殖相關(guān)熱休克蛋白90(heatshockproteins，HSP90)、賈納斯激酶2(januskinase，JAK2)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)基因的表達胃癌細胞SGC-7901經(jīng)姜黃素處理后，HSP90 mRNA、JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.05)，且具有明顯的濃度依賴性，即隨著姜黃素處理濃度的增大，其對細胞中增殖相關(guān)基因表達的抑制效果越明顯。見圖3。

圖3 姜黃素對胃癌細胞SGC-7901中相關(guān)基因表達的影響

2.4姜黃素處理抑制胃癌細胞增殖相關(guān)蛋白HSP90、JAK2和STAT3的表達/激活各濃度姜黃素均未顯著影響胃癌細胞JAK2與STAT3表達水平(圖4統(tǒng)計圖中未展示)。25 μmol/L姜黃素處理對胃癌細胞中HSP90表達、JAK2和STAT3的表達與激活(p-JAK2和p-STAT3)水平?jīng)]有顯著影響。而35 μmol/L姜黃素可導(dǎo)致胃癌細胞中HSP90表達水平、JAK2和STAT3激活水平的顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖4。

圖4 姜黃素對胃癌細胞SGC-7901中相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

控制癌細胞轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后狀況的重要因素[5]。阻斷胃癌細胞的轉(zhuǎn)移成為目前醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域急需解決的問題。研究[6]顯示，植物中的某些活性化合物，如紫衫烷、姜黃素在腫瘤治療方面發(fā)揮著相關(guān)作用。如在結(jié)腸癌細胞中，姜黃素衍生物降低了癌細胞的增殖遷移，促進了癌細胞凋亡[7]。本實驗檢測了不同濃度姜黃素對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響。結(jié)果表明，姜黃素顯著抑制了癌細胞的增殖，且濃度增加，抑制效果越強。Transwell和劃痕試驗結(jié)果顯示，姜黃素也對受試胃癌細胞的侵襲和遷移具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。這與之前的報道相一致[7-8]。

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過程。其中，癌細胞中增殖相關(guān)信號通路的異常激活發(fā)揮著重要作用，而其顯著特點是關(guān)鍵蛋白表達與激活水平的升高[1-2]。JAK2/STAT3 信號通路在多種腫瘤中都有激活。STAT3經(jīng)磷酸化的方式活化后進入胞核參與調(diào)控多種基因的表達，介導(dǎo)腫瘤細胞的增殖、侵襲和血管生成等。抑制JAK活性可抑制STAT3核轉(zhuǎn)位與腫瘤形成。本研究顯示，姜黃素處理組(特別是35 μmol/L濃度組)的胃癌細胞內(nèi)，無論在mRNA水平還是蛋白水平，STAT3及其上游調(diào)控蛋白JAK的激活均顯著下調(diào)，并且這些基因表達與蛋白激活水平的變化也伴隨著細胞增殖與侵襲遷移能力的下降。說明姜黃素可能是通過改變胃癌細胞JAK/STAT3信號通路的激活來調(diào)控胃癌細胞的增殖、侵襲遷移。在胃癌細胞中，p-JAK及p-STAT3可能是持續(xù)高表達的，這對于胃癌的發(fā)生、癌細胞的浸潤與遷移具有重要的輔助作用[9]。而本研究用35 μmol/L姜黃素處理胃癌細胞24 h后，才出現(xiàn)對p-JAK及p-STAT3的顯著抑制效果(但仍然具有較高表達水平)，這可能是由于胃癌細胞對藥物具有較強抵抗性。

分子伴侶HSP90在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性實體腫瘤中高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與其耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α在多種上皮細胞癌中高表達，參與多種靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，其中多數(shù)蛋白產(chǎn)物可促進血管形成并誘導(dǎo)腫瘤細胞對缺氧的適應(yīng)，最終促進其轉(zhuǎn)移與侵襲[12]。而HSP90對維持HIF的正確構(gòu)象或募集其他輔助因子必不可少[13]。HSP90表達也可促進STAT3磷酸化激活，而p-STAT3可促進熱休克因子作用于HSP90基因靶點上，從而促進HSP90基因的轉(zhuǎn)錄[14]。本研究表明，姜黃素顯著抑制了胃癌細胞HSP90的mRNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達水平，說明姜黃素能夠通過下調(diào)胃癌細胞HSP90來發(fā)揮抗腫瘤功效。

本研究揭示了姜黃素可通過抑制胃癌細胞Hsp90-JAK/STAT3信號通路激活來限制其侵襲和遷移，對于胃癌的臨床治療具有一定借鑒意義。但其臨床應(yīng)用效果及安全性等有待進一步研究。