兒童急性淋巴細胞白血病中SOCS3通過STAT3信號通路調(diào)節(jié)Treg細胞表達

黃玲玲，王寧玲，吳正玉，劉亢亢，儲金華，楊林海

近年來隨著對急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)發(fā)生機制的深入研究，國內(nèi)外學(xué)者[1-2]發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞高表達導(dǎo)致的免疫抑制與ALL細胞惡性克隆相關(guān)，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)與兒童ALL之間存在密切關(guān)系，控制ALL患者體內(nèi)Treg細胞的數(shù)量和功能可以提高ALL患者的抗腫瘤免疫能力及白血病微小病變殘留的清除能力。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)能夠通過抑制Janus蛋白質(zhì)酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus protein tyrosine/singal transducer and activator of transcription 3，JAK/STAT3)信號的行為間接參與到調(diào)控T淋巴細胞分化、成熟的過程，在調(diào)控體內(nèi)Treg細胞表達中起到關(guān)鍵作用[3-4]。該研究測定兒童ALL中SOCS3與Treg細胞表達水平的關(guān)系, 探討SOCS3在兒童ALL疾病狀態(tài)和危險度評估、腫瘤免疫以及靶向治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1病例資料研究對象：2015年1～12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科血液病區(qū)住院的新診斷ALL患兒。納入標準：符合細胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)診斷標準的ALL，入組年齡1個月～18歲，中位年齡5.8歲，排除以下情況：成熟B急性淋巴細胞白血病、混合表型的急性白血病、免疫缺陷性疾病、第二腫瘤、非初治的ALL。依據(jù)初治時疾病危險度將患兒分組，共分為低危(low risk, LR)、中危(moderate risk, MR)和高危(high risk, HR) 3組，化療方案采用中國兒童ALL多中心治療研究方案(急性淋巴細胞白血病-2015方案)，該化療方案包括三個階段，分別為誘導(dǎo)緩解化療、鞏固化療治療、維持化療治療。兒童ALL染色體核型異常并形成融合基因包括TEL-AML基因、BCR/ABL基因、POX基因、MLL基因等。最終確定入組ALL病例45例，其中女性患者22例，男性患者23例，患兒年齡為8個月～14歲，中位年齡為5.8歲，入組患兒的相關(guān)臨床特點見表1。同時設(shè)置正常對照組，正常對照組選擇13名健康兒童，其中女孩7例，男孩6例，正常對照組兒童年齡3～14歲，中位年齡5.8歲。兩組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。所有確診ALL的入組患兒和正常對照組健康兒童資料中均留存廢棄標本用于科學(xué)研究知情同意書，該知情同意書由其監(jiān)護人簽署。

表1 45例ALL患兒的臨床特點

1.2外周血單個核細胞和RNA的提取用無菌乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA) 抗凝管留取ALL患兒和正常兒童外周血3 ml，加入Ficoll分離液(天津生物科技有限公司)，按照說明提取外周血單個核細胞。按照TRIzol法(美國Invitrogen公司)提取RNA，提取后的RNA溶于10 μl DEPC水中，微量光度計測定所有RNA樣本A260/A280為1.8～2.0。

1.3熒光定量PCR反應(yīng)以O(shè)ligo d(T)為引物(美國Invitrogen公司)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國Themero Scientific 公司)說明書進行cDNA合成；按照SYBR-Green試劑(美國Themero Scientific公司)說明書進行熒光定量PCR反應(yīng)。SOCS3前引物序列：5’-CAGCTCCAAGAGCGAGTACCA-3’；SOCS3后引物序列：5’-AGAAGCCGCTCTCCTGCAG-3；STAT3前引物序列：5’-AGGAGGAGGCATTCGGAAA-3’；STAT3后引物序列：5’-AGCGCCTGGGTCAGCTT-3’；內(nèi)參基因GADPH前引物序列：5’-AATGGAAATCCCATCACCATCT-3’；GADPH后引物序列：5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’。

1.4流式細胞術(shù)測定Treg細胞水平采用全血直接計數(shù)法，以CD4-異硫氰酸熒光素(FITC) 設(shè)門，固定、破膜，別藻青蛋白(APC) 標記的FOXP3抗體染色30 min，檢測CD4+CD25+FOXP3+T淋巴細胞比例。

2 結(jié)果

2.1ALL患兒初診時SOCS3mRNA表達水平測定45例初診組ALL患兒初診時SOCS3 mRNA水平和正常對照組13例健康兒童的SOCS3 mRNA水平，測定數(shù)據(jù)顯示兩組SOCS3 mRNA相對表達量分別為(0.62±1.04)和(4.25±2.37)。該結(jié)果表明，初診組患兒在初診時SOCS3 mRNA的表達水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.759，P<0.05)。

2.2ALL患兒初診時STAT3mRNA表達水平測定45例初診組ALL患兒初診時和正常對照組13例正常兒童的STAT3 mRNA水平， STAT3 mRNA相對表達量分別為(3.11±1.17)和(0.87±0.14)，初診組患兒在初診時STAT3 mRNA表達水平是增高的，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.54，P<0.05)。

2.3ALL患兒初診時Treg細胞水平用流式細胞術(shù)檢測了初診組45例ALL患兒初診時和13例正常對照組兒童的Treg細胞表達水平，見圖1。對比數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，ALL患兒初診Treg細胞水平增高，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.163，P<0.05)，見表2。

圖1 初診組ALL患兒與正常對照組兒童Treg細胞表達水平

表2 初診組ALL患兒與正常對照組兒童Treg細胞表達水平

2.4ALL患兒初診時SOCS3、STAT3、Treg細胞表達相關(guān)性初診組ALL患兒STAT3的表達水平與Treg細胞表達水平呈正相關(guān)性(Treg：r=0.751，P<0.05)，而SOCS3的表達水平分別與STAT3、Treg細胞表達水平均呈負相關(guān)性(STAT3：r=-0.61，P<0.05； Treg：r=-0.558,P<0.05)，見圖2。

圖2 初診組ALL患兒STAT3、SOCS3、Treg細胞表達水平相關(guān)關(guān)系散點圖

3 討論

Treg細胞作為免疫抑制性細胞，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[5-6]，Treg細胞在血液系統(tǒng)腫瘤患者中表達水平增高、Treg細胞數(shù)量增加以及Treg細胞在腫瘤患者中功能增強都有利于腫瘤發(fā)展及生長，從而影響疾病的進展及進程。對于Treg細胞表達水平與兒童ALL之間存在的關(guān)系，以往的研究[1，7]表明在兒童ALL中存在Treg細胞表達水平增高的現(xiàn)象，本研究通過測定45例ALL患兒和正常對照組兒童Treg細胞表達水平，結(jié)果同樣證實在兒童ALL中Treg細胞表達水平增高，然而引起ALL患兒Treg細胞表達水平增高的機制目前尚不清楚。

隨著對Treg細胞表達調(diào)節(jié)機制的深入研究，STAT3在調(diào)節(jié)Treg細胞表達中起到了重要的作用[8]，STAT3與CD4+T細胞上白介素-6受體結(jié)合，上調(diào)叉頭蛋白-3的表達，促進了Treg細胞的活化。由此推論如果抑制了STAT3的表達，則可以直接或間接抑制Treg細胞的活化[9]。為探討在兒童ALL中STAT3與Treg細胞表達水平的關(guān)系，本研究同時測定了兒童ALL中STAT3表達水平，結(jié)果顯示兒童ALL中STAT3、Treg細胞水平明顯增高，提示在兒童ALL中STAT3的異常表達可能是導(dǎo)致Treg細胞水平增高的原因之一。

SOCS3是SOCS家族中的重要一員，是負性調(diào)控JAK/STAT3信號通路中重要的一種分子，在某些類型白血病中發(fā)現(xiàn)SOCS3存在低表達的現(xiàn)象，SOCS3低表達可導(dǎo)致STAT3的持續(xù)磷酸化[10-11]。課題組前期曾探討兒童急性淋巴細胞白血病SOCS3的表達水平與ALL臨床特點和ALL早期治療反應(yīng)的相關(guān)性，相關(guān)數(shù)據(jù)可以證實：兒童ALL中存在SOCS3表達下調(diào)的現(xiàn)象，但SOCS3在疾病誘導(dǎo)緩解后能夠恢復(fù)正常表達[11]。為了探討在兒童ALL中SOCS3和STAT3兩者的關(guān)系，本研究同時測定了急ALL患兒中SOCS3的表達水平，結(jié)果表明SOCS3的表達水平在ALL兒童中明顯降低，提示在兒童ALL中SOCS3負性調(diào)節(jié)STAT3的表達，SOCS3的低表達導(dǎo)致STAT3的持續(xù)活化，從而引起Treg細胞的高表達。SOCS3對Treg細胞的調(diào)節(jié)作用，為白血病的免疫治療提供了新思路。

近年來SOCS3得到了學(xué)者們廣泛關(guān)注及深入研究，其作為可能的抑癌基因參與了各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，參與了腫瘤的進展及病程[12-14]，課題組前期研究[11]揭示了SOCS3與兒童ALL發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，SOCS3在ALL兒童中的低表達可以導(dǎo)致ALL中STAT3的持續(xù)活化，因此監(jiān)測ALL患者中SOCS3水平可以了解疾病狀態(tài)并可以評價危險度[10-11]。然而兒童ALL中SOCS3低表達的機制目前尚不清楚，SOCS3的低表達與兒童ALL長期無事件生存的關(guān)系以及STAT3的持續(xù)活化引起的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞表達增高的具體作用機制還有待進一步研究。有學(xué)者在關(guān)于肝癌的研究[15]表明SOCS3基因的甲基化可以引起SOCS3的低表達，接下來本研究計劃測定SOCS3基因甲基化水平，進一步探究SOCS3低表達的分子機制，同時繼續(xù)跟蹤隨訪入組研究對象的長期無事件生存情況。