銀線草HPLC－ESI－MS的研究

袁琴琴

(菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東菏澤 274000)

銀線草(Chloranthus japonicusSieb．)為金粟蘭科金粟蘭屬多年生的草本植物，以根或者全草入藥，具有消炎止痛、解蛇毒等功效，在民間應(yīng)用廣泛［1－2］。銀線草中的酚酸類和香豆素在其主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，酚類成分和香豆素類成分具有良好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗激素、抗血栓、抗變態(tài)反應(yīng)等活性［3－6］。由于它們特殊的生理作用，研究酚類和香豆素類化合物具有十分重要的意義。目前，單體化合物提取比較困難，本研究通過液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對銀線草中的主要成分進行質(zhì)普檢測，根據(jù)各個色譜的ESI質(zhì)譜信息和色譜圖中主要峰的出峰時間以及各化學(xué)成分的相對分子質(zhì)量，結(jié)合前人的文獻對迷迭香酸、反丁烯二酸、異秦皮啶、綠原酸進行了初步表征。

1 實驗材料和儀器

1．1 實驗材料

銀線草樣品于2010年7月底采集于陜西省太白山，經(jīng)生命科學(xué)院田先華教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物銀線草(Chloranthus japonicusSieb．)。

1．2 實驗試劑

甲醇(美國Fisher公司，色譜純);甲酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純);所用水均為超純水;標(biāo)準(zhǔn)品:迷迭香酸(批號:07902PH)，異秦皮啶(批號:110837－200707)，反丁烯二酸(批號:11154－200001)，綠原酸(批號:110753200413)(中國藥品生物制品檢定所)。

1．3 實驗儀器

LC2010 AHT HPLC(日本SHIMADZU島津公司);SL202N型電子秤(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);MILLI－Q超純水儀器(MILLIPORE公司);RE250AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器公司);KQ5200超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);色譜柱 Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美國Phenomenex公司);SL202N型電子秤(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);色譜柱Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美國 Phenomenex公司)。

2 實驗方法

2．1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

適量精密稱取反丁烯二酸、異秦皮啶、綠原酸和迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配置混合標(biāo)品，溶液須經(jīng)0．22μm有機相濾膜過濾。

2．2 銀線草溶液制備

太白山地點的銀線草粉末1 g，加5 mL的70%甲醇超聲提取30 min兩次，合并提取液，搖勻，用0．22 m微孔濾膜濾過，即得銀線草樣品溶液。

2．3 實驗方法

2．3．1 色譜條件

色譜柱采用 Phenomenex C18(250 mm ×4．6 mm，5μm)流動相:A磷酸水，B甲醇:脫條件條件:0～5 min，甲醇15% ～25%;5～20 min，甲醇 25% ～30%;20～45 min，甲醇 30% ～40%;45 ～95min，甲醇40% ～60%。B;流速0．8 mL/min;檢測波長323 nm;柱溫25℃;記錄時間95 min;進樣量10μL。

2．3．2 質(zhì)譜條件

干燥氣流速4 L/min，干燥氣溫度180℃，電噴霧離子化(ESI)，負離子方式檢測，Auto MSn，掃描范圍50～1000 m/z。

3 結(jié)果分析

通過樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰的MS數(shù)據(jù)和出峰時間以及相關(guān)文獻報道進行比較分析，初步鑒定出4個化合物。

1號峰。銀線草樣品和反丁烯二酸標(biāo)品的HPLC出峰時間均為6．5 min(圖3);銀線草樣品溶液在6．5 min一級質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z與反丁烯二酸標(biāo)品的ESI質(zhì)譜圖得到的信息一致，均為115(圖1、2)。根據(jù)以上信息，初步推斷該物質(zhì)反丁烯二酸，相對分子質(zhì)量為116?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖4。

2號峰。銀線草樣品和綠原酸標(biāo)品的HPLC出峰時間均為15．9 min(圖3)，銀線草樣品溶液在15．9 min一級質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z與綠原酸標(biāo)品的ESI質(zhì)譜圖顯示的信息一致，m/z均為353(圖1、2)，根據(jù)以上信息，初步推斷該物質(zhì)為綠原酸，相對分子質(zhì)量為354，首次發(fā)現(xiàn)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的ESI質(zhì)譜圖Fig．1 TIC spectrum of standard compounds

圖2 銀線草樣品的ESI質(zhì)譜圖Fig．2 TIC spectrum of Chloranthus japonicus Sieb

圖3 標(biāo)品的HPLCFig．3 HPLC of standard compounds

3號峰。異秦皮啶標(biāo)品出峰時間為29．8 min(圖3)，銀線草樣品在同樣時間出峰，銀線草樣品溶液在29．9 min一級質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z為353，而異秦皮啶ESI質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子的m/z卻為221(圖1、2)，綜合該物質(zhì)的HPLC出峰時間和ESI質(zhì)譜信息，初步推斷該物質(zhì)為異嗪皮啶，相對分子質(zhì)量為222，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

4號峰。迷迭香酸標(biāo)品出峰時間為58．3 min(圖3)，銀線草樣品在同樣時間出峰，迷迭香酸ESI質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子［M－H］－的m/z為359(圖1、2)，銀線草樣品溶液一級質(zhì)譜顯示出分子離子［M－H］－的m/z為359，綜合該物質(zhì)的HPLC出峰時間和ESI質(zhì)譜信息，初步推斷該物質(zhì)為迷迭香酸，相對分子質(zhì)量為360，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 化學(xué)式Fig．4 Chemical formula

4 結(jié)論

質(zhì)譜技術(shù)是鑒定化合物的一種手段，具有高選擇性和高靈敏的優(yōu)點，而液相質(zhì)譜技術(shù)融合了具有高效的分離能力的高效液相方法以及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜方法。這種技術(shù)不但彌補了紫外檢測的不足，還可以提供化學(xué)成分的信息，在未知化合物結(jié)構(gòu)的探索上和新藥的研究及開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用。

本實驗采用高效液相色譜技術(shù)根據(jù)其出峰時間和ESI質(zhì)譜信息，初步確定銀線草中含有反丁烯二酸，異嗪皮啶、綠原酸和迷迭香酸。為全面分析其活性成分和銀線草藥材的質(zhì)量考察指標(biāo)提供資料