不同微生物發(fā)酵豆粕的差異化研究

葉耀輝 鐘魯龍 雷松波 王金寶

（福建省寧德市農業(yè)科學研究所，福建寧德 355017）

豆粕是現代養(yǎng)殖中使用最普遍的蛋白質原料，同時，豆粕本身含有多種抗營養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植酸鹽等[1]，降低了畜禽對飼料的利用效率。利用微生物固態(tài)發(fā)酵的方法，可以很好地去除豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、植酸、脂肪氧化酶等[2]，選擇合適的微生物組合，也可以提高豆粕粗蛋白、小分子蛋白、多肽等的含量[3,4]，提高豆粕的營養(yǎng)價值。發(fā)酵豆粕一般直接在飼料中添加使用，可提高畜禽生長性能[5,6]，降低水產飼料中魚粉使用量等[7]。發(fā)酵所用微生物菌株和發(fā)酵后干燥工藝對發(fā)酵豆粕營養(yǎng)價值影響很大，特別是發(fā)酵后的干燥工段大大降低了發(fā)酵豆粕的風味和適口性，且會損失部分益生菌和益生物質。近年來，隨著微生物與固態(tài)發(fā)酵技術的普及，一些規(guī)模化養(yǎng)殖場開始在養(yǎng)殖現場直接進行豆粕固態(tài)簡易發(fā)酵，以最大程度保留發(fā)酵豆粕的酸香風味和益生物質，主要在幼齡動物和種豬飼料中添加使用。由于養(yǎng)殖場技術力量有限，所選菌種一般是網購的復合菌劑，發(fā)酵條件也比較簡陋，一般是將豆粕直接裝在桶或者袋子中簡易發(fā)酵7～15 d后直接使用，對最終發(fā)酵后的豆粕營養(yǎng)組分變化不清楚，導致現場制作的發(fā)酵豆粕質量層次不齊，甚至存在霉菌超標的問題，反而對動物有害。本研究選擇了用于豆粕發(fā)酵的幾種常用益生菌，分別對豆粕進行發(fā)酵處理，研究不同微生物在豆粕發(fā)酵過程中產生的一系列微生物和生化指標變化的差異，評估不同發(fā)酵條件下可能存在的潛在風險，為養(yǎng)殖場現場發(fā)酵提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（編號：CICC6075）；釀酒酵母購于安琪酵母股份有限公司；枯草芽孢桿菌購于福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司。豆粕購于泉州福海糧油工業(yè)有限公司；硫酸銨為分析純級，其他試劑均為工業(yè)級。

1.2 發(fā)酵液制備

嗜酸乳桿菌制備：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、無水乙酸鈉0.5%、檸檬酸鈉0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸銨0.02%、吐溫0.1%、水1 000 mL，pH值調至6.2～6.6之間，發(fā)酵48 h左右停止發(fā)酵，將發(fā)酵液用蒸餾水調制到菌數為109CFU/mL數量級，備用。

枯草芽孢桿菌制備：將菌粉加蒸餾水調制到菌濃度為109CFU/mL數量級，備用。

釀酒酵母制備：將安琪酵母加蒸餾水調節(jié)菌濃度到109CFU/mL數量級，備用。

1.3 基礎物料配制及接種發(fā)酵

基礎物料配制與接種：豆粕與水按2∶1比例，枯草芽孢桿菌菌液、嗜酸乳桿菌發(fā)酵液、釀酒酵母菌液分別按豆粕重量的10%進行接種。分別在20℃、37℃進行厭氧固態(tài)發(fā)酵，在第1 d（D1）、第3 d（D3）、第7 d（D7）、第15 d（D15）取樣進行分析，測定接種微生物活菌總數、霉菌總數以及小分子蛋白等生化指標。

1.4 小分子蛋白含量測定

取1 g發(fā)酵豆粕溶于50 mL蒸餾水中，調pH值至4.5后進行沉淀，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用Folin-酚法測定蛋白含量[8]。

1.5 垂直板狀十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）

參照Laemmli方法[9]，分離膠質量濃度為125 g/L，濃縮膠質量濃度為44 g/L，電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍染色。豆粕蛋白抽提液用非還原電泳處理液進行處理。

2 結果與討論

2.1 不同接種菌株發(fā)酵過程微生物指標變化情況

根據發(fā)酵實際條件，豆粕不經任何處理，與水按比例混合后，分別接種不同益生菌，厭氧發(fā)酵，在不同時間取樣測定相應的微生物指標。

由表1可知，10%接種量接種不同益生菌，不同的溫度條件下，益生菌生長情況差異很大。20℃時，3種菌株的生長均不明顯，1周后，菌株數量普遍下降，說明溫度較低時，豆粕發(fā)酵程度很低，達不到發(fā)酵的目的。在37℃條件下，無論芽孢類、乳酸菌類還是酵母類，均生長迅速，尤其以芽孢桿菌萌發(fā)生長最快，持續(xù)較長時間時活性菌體數仍然很高。接種乳酸菌和酵母菌1周后，有效活性菌數明顯減少。若希望豆粕在發(fā)酵中能夠提供有效的益生微生物，則發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間都應該控制在合適范圍內。從表觀性狀看，芽孢桿菌類發(fā)酵豆粕顏色偏紅，氣味一般；乳酸菌發(fā)酵豆粕有酸香味，味道最佳；酵母菌發(fā)酵豆粕則有酒香味，時間越長，酒味越濃，不利于動物采食。

表1 接種微生物菌數變化情況

簡易發(fā)酵豆粕外觀看基本沒有霉菌，但仍然有霉菌感染的風險，在上述條件下，霉菌總數測定結果如表2。

表2 霉菌總數變化情況

接種益生菌7 d和15 d時，表觀觀察未發(fā)現霉變現象。表2取樣測定結果顯示，1周后，接種芽孢桿菌和酵母菌豆粕中霉菌的數量均有增加，尤其是在37℃條件下，霉菌含量明顯上升。15 d時，接種枯草芽孢桿菌的豆粕霉菌總數已接近霉菌的限量標準。說明在簡易發(fā)酵操作實踐中，雖然發(fā)酵豆粕外觀看不出太大的差異性，但豆粕內部已經有不同數量的霉菌，隨著發(fā)酵時間延長，必然會造成發(fā)酵豆粕霉菌毒素含量的增加，對養(yǎng)殖動物有一定的負面作用。從微生物指標看，養(yǎng)殖場現場發(fā)酵豆粕時必須嚴格控制發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間，尤其在夏季高溫時發(fā)酵時間應控制在1周之內。

2.2 不同接種菌株發(fā)酵過程生化指標變化情況

從生產實際來看，對豆粕進行固態(tài)發(fā)酵主要是希望解決豆粕抗原的問題。豆粕中的主要抗營養(yǎng)因子是抗原蛋白，利用微生物對豆粕進行發(fā)酵處理，可以降解豆粕中的7S和11S球蛋白[10]，生成具有益生功能的活性小分子物質。不同微生物對豆粕固態(tài)發(fā)酵后的小分子含量差異很大，結果見表3。

表3 小分子蛋白的差異

由表3可知，芽孢類微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕后產生的小分子蛋白最多，可達8%以上，其次是乳桿菌類發(fā)酵豆粕，最次是釀酒酵母。20℃時，從小分子蛋白含量變化情況看，豆粕發(fā)酵程度非常低，遠遠低于37℃條件下的發(fā)酵水平。從時間上看，在第3 d后，小分子蛋白的含量雖略有上升，但基本上變化不大，顯示前3 d的豆粕發(fā)酵至關重要，此段時間，菌株處于最佳的活力狀態(tài)，且在分子水平對豆粕的發(fā)酵已基本完成。

2.3 不同接種菌株發(fā)酵豆粕蛋白SDS-PAGE比較分析

不同微生物發(fā)酵豆粕7天后，分別取樣抽提蛋白，經非還原電泳處理液處理后，進行SDS-PAGE分析，如圖1所示。

圖1 不同微生物發(fā)酵豆粕蛋白電泳圖

從圖1可以明顯看出，37℃條件下，芽孢桿菌發(fā)酵處理后的豆粕大分子蛋白條帶明顯變淺，大部分被發(fā)酵處理成低于20 KDa分子量的小分子蛋白，其次是乳酸菌和酵母菌。而在20℃條件下，3種微生物發(fā)酵豆粕對大分子蛋白的酵解程度均比較低。相關研究表明，豆粕中大分子蛋白質含量與小腸絨毛高度隱窩深度呈負相關[11]，這也是發(fā)酵豆粕降低大分子蛋白含量后有利于改善幼畜腸道平衡的原因。

本研究數據顯示，用不同種類的微生物對豆粕進行固態(tài)發(fā)酵處理，均可以不同程度地降低豆粕主要抗原因子7S和11S球蛋白的水平，相應地提高發(fā)酵豆粕的小分子物質含量，從而使發(fā)酵豆粕應用于仔豬時，可以降低腹瀉率，提高消化酶活性，促進仔豬腸道發(fā)育，提高斷奶仔豬生長性能[12]。應用于肉雞和肉鴨則可以提高增重，改善料重比，并降低盲腸大腸桿菌數量，增加乳酸菌數量，改善腸道微環(huán)境[13,14]。乳酸菌和酵母菌類微生物可以明顯提高發(fā)酵豆粕的香味和適口性，經常作為復配菌種，應用于多菌種發(fā)酵豆粕的研究中[15]。

3 結論

發(fā)酵豆粕應用效果的差異關鍵在于發(fā)酵微生物的選擇。在養(yǎng)殖場簡易發(fā)酵時，應根據生產實際需要，選擇合適的微生物菌株或者菌株組合。芽孢類微生物發(fā)酵有助于提高小分子蛋白的含量，乳酸菌類微生物則有助于提高豆粕適口性。發(fā)酵時應注意溫度與時間的控制，夏季發(fā)酵時間應不超過1周，冬季發(fā)酵時間適當延長到2周或以上。養(yǎng)殖場應配置簡易的微生物測定工具，隨時監(jiān)控豆粕發(fā)酵過程的微生物變化，防止?jié)撛诘奈⑸锇踩L險。不同微生物對豆粕的酵解程度不同，發(fā)酵豆粕的利用價值差異很大。工業(yè)化制備發(fā)酵豆粕時，一般采用復合菌種進行好氧或厭氧發(fā)酵，在降低豆粕抗營養(yǎng)因子、提高豆粕功能性多肽含量等方面均有很好的效果。