佛手苷內(nèi)酯對(duì)磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制*

楊子鍵，黃君瑤，高燁飛，黃文吉，徐世磊，金晶晶，萬(wàn)燁東，嚴(yán) 明，毛紅嬌，張 云△

(1. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江 紹興 312000；2. 杭州電子科技大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，浙江 杭州 310018)

人工關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期磨損、碰撞會(huì)產(chǎn)生大量的聚乙烯(polyethylene，PE)、鈦(titanium，Ti)和磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)等磨損顆粒，這些微米粒徑的細(xì)小顆?？杉せ罴袤w周?chē)鷨魏?巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞等組織細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，以上破骨細(xì)胞活化這些因子可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和假體周?chē)侨芙?，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體晚期松動(dòng)及人工關(guān)節(jié)置換失敗[1, 2]。假體周?chē)撕猩鲜鼋M織細(xì)胞外，還存在著豐富的骨細(xì)胞(osteocyte)，其數(shù)量占骨組織細(xì)胞的90%～95%。以往研究和本室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磨損顆粒誘導(dǎo)假體周?chē)羌?xì)胞損傷及凋亡[3, 4]，釋放 TNF-α、IL-1β和IL-6等因子，促進(jìn)假體周?chē)装Y性骨溶解[1, 2, 5]。因此，骨細(xì)胞在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周?chē)侨芙庵邪l(fā)揮重要的作用，是防治假體周?chē)侨芙饧瓣P(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新的靶細(xì)胞。

有研究顯示雙膦酸鹽類(lèi)藥物可抑制循環(huán)疲勞載荷誘導(dǎo)或骨質(zhì)疏松大鼠尺骨或椎骨中骨細(xì)胞活性降低，減少骨細(xì)胞凋亡[6, 7]，阻止假體周?chē)侨芙夂完P(guān)節(jié)松動(dòng)。但是，雙磷酸鹽類(lèi)藥物存在副作用多，不宜長(zhǎng)期服用等缺點(diǎn)[8]。因此，尋找一種高效、毒副作用少，且能長(zhǎng)期應(yīng)用于阻止假體周?chē)羌?xì)胞損傷和凋亡，減輕假體周?chē)侨芙饧瓣P(guān)節(jié)松動(dòng)的藥物已經(jīng)迫在眉睫。

佛手苷內(nèi)酯(bergapten，BP，圖1)是從佛手、當(dāng)歸和白芷等中藥材中提取的一種天然香豆素類(lèi)化合物，目前已用于炎癥和腫瘤等方面的治療[9-11]。有研究證實(shí)佛手苷內(nèi)酯能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及新骨形成[12]，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞凋亡而抑制骨吸收[13]，可用于治療骨折、骨軟化和骨質(zhì)疏松癥。但是，佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞損傷的影響如何，目前尚不明確。本研究構(gòu)建TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4損傷體外模型，觀察佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞損傷及凋亡的影響，并闡明其可能作用機(jī)理，為佛手苷內(nèi)酯用于防治假體周?chē)侨芙夂完P(guān)節(jié)松動(dòng)提供一種新的治療靶點(diǎn)。

Fig. 1 Chemical structure of bergapten (MW=216.19)

1 材料與方法

1.1 材料

TCP磨損顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈(zèng)；小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4由美國(guó)密蘇里大學(xué)口腔學(xué)院Bonewald教授饋贈(zèng)。佛手苷內(nèi)酯(HPLC≥95%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和小牛血清(CS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Calcein-AM活體分子探針、MTT、TRIzol、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Applied BiosystemTMSYBRTM試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；兔抗GRP78抗體、兔抗PERK抗體、兔抗phospho-PERK(p-PERK)抗體、兔抗eIF2α抗體、兔抗phospho-eIF2α(p-eIF2α)抗體、兔抗ATF4抗體、兔抗CHOP抗體、兔抗caspase-3抗體和小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 骨細(xì)胞MLO-Y4的培養(yǎng)

第39代小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4復(fù)蘇后加入含有2.5% FBS和 2.5%CS的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37 °C、5% CO2及飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，24 h后換新的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞80%～85%鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底時(shí)加入0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化2～3 min進(jìn)行傳代。

1.3 佛手苷內(nèi)酯的毒性劑量研究

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，加入佛手苷內(nèi)脂(0.2 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)孵育48 h后，加入MTT(5 mg/ml)溫室避光孵育4 h；棄上清液后，加入二甲基亞砜(DMSO，200 μl)溶解甲瓚；充分振搖后，置于酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm和OD690nm，計(jì)算各組骨細(xì)胞的活性變化，確定佛手苷內(nèi)脂的毒性劑量。

1.4 TCP磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞損傷模型的制備及分組

取骨細(xì)胞MLO-Y4(1×104cells/ml)接種于96孔、24孔或6孔培養(yǎng)板中孵育24 h后，傾去培養(yǎng)基，加入TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)繼續(xù)共孵育48 h建立骨細(xì)胞損傷體外模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照(Control)組、TCP磨損顆粒(TCP，0.1 mg/ml)組、佛手苷內(nèi)酯(1 μmol/L)組、佛手苷內(nèi)酯(5 μmol/L)組和佛手苷內(nèi)酯(20 μmol/L)組。

1.5 MTT法和Calcein-AM染色檢測(cè)細(xì)胞活性和形態(tài)的變化

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，采用篩選出的佛手苷內(nèi)脂有效干預(yù)劑量(1 μmol/L、5 μmol/L、20 μmol/L)預(yù)孵育4 h后，加入TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)后分別繼續(xù)孵育48 h。加入MTT(5 mg/ml)溫室避光孵育4 h；棄上清液后，加入二甲基亞砜(DMSO，200 μl)溶解甲瓚；充分振搖后，置于酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm和OD690nm，計(jì)算各組骨細(xì)胞的活性變化。

1.6 Calcein-AM染色觀察骨細(xì)胞形態(tài)改變

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于打孔皿中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。去除培養(yǎng)基后加入Calcein-AM(5 μmol/L)室溫避光孵育30 min，PBS清洗后置于激光共聚焦下觀察骨細(xì)胞形態(tài)和活性變化。

1.7 Hoechst3342染色觀察骨細(xì)胞凋亡

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于打孔皿中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。去除培養(yǎng)基后加入Hoechst 33342染色液(5 μmol/L)室溫避光孵育5 min，PBS清洗2次后置于激光共聚焦下觀察骨細(xì)胞核染色質(zhì)聚集、核碎裂及胞質(zhì)濃縮等情況。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。然后通過(guò)消化獲取骨細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心10 min去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次。 然后加入5 μl Annexin V-FITC/10 μl碘化丙啶(PI)，避光室溫37℃溫育15 min。最后加入200 μl PBS并混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組骨細(xì)胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)575 nm。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)骨細(xì)胞特征蛋白的mRNA水平

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。。然后加入TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用Applied BiosystemTMSYBRTM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。設(shè)置程序：95℃ 5 min預(yù)變性，后以95℃ 30 s變性、56℃ 30 s退火、72℃ 40 s延伸等45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，最后37℃ 30 s。導(dǎo)出擴(kuò)增曲線，記錄Ct值，以mRNA水平以相對(duì)定量(GADPH)表示，應(yīng)用2-△△Ct測(cè)定，引物序列見(jiàn)表1。

Tab. 1 Sequences of PCR primers

1.10 Western blot檢測(cè)PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取骨細(xì)胞(1×104cells/ml)接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。。去除培養(yǎng)基后，每孔加入RIPA裂解液(100 μl)冰上裂解30 min。經(jīng)13 000 r/min離心15 min上清液，利用BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔抗GRP78抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗PERK抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗p-PERK抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗eIF2α抗體和兔抗p-eIF2α抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗ATF4抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗CHOP抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗capase-3抗體(1∶1 000稀釋)和小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞活性改變的影響

MTT活性檢測(cè)結(jié)果顯示：佛手苷內(nèi)酯濃度在1～20 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)正常骨細(xì)胞MLO-Y4無(wú)毒性作用，骨細(xì)胞活性變化不大(圖2A)。而佛手苷內(nèi)酯(40 μmol/L)可明顯抑制MLO-Y4細(xì)胞增殖，細(xì)胞活性明顯降低，僅為Control組的64.07%。據(jù)此，本研究選取1 μmol/L、5 μmol/L和20 μmol/L為干預(yù)劑量。

MTT檢測(cè)和Calcein-AM染色結(jié)果表明：與Control組比較，TCP組骨細(xì)胞MLO-Y4活性顯著降低，偽足明顯減少，其細(xì)胞活性減少為Control組的 44.95%(圖2B、圖2C，P<0.05)；與TCP組比較，佛手苷內(nèi)酯處理組骨細(xì)胞活性及偽足明顯增加，呈一定的劑量依賴(lài)性，細(xì)胞活性分別增加為T(mén)CP組1.04倍(1 μmol/L)、1.53倍(5 μmol/L)和2.19倍(20 μmol/L)(圖2B、圖2C，P<0.05)。

A, B: Cell viability measured by MTT;C： Representative morphology of MLO-Y4 cells (Calcein-AM, ×200); TCP: Tricalcium phosphate; MTT: Tartrate resistant acid phosphatase; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

2.2 佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)結(jié)果顯示：與Control組比較，TCP組骨細(xì)胞核染色質(zhì)聚集、核碎裂及胞質(zhì)濃縮等典型形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞膜外翻，凋亡率顯著增加為Control組的7.61倍(圖3、圖4，P<0.05)，并伴隨caspase-3的活化。與TCP組比較，佛手苷內(nèi)酯組骨細(xì)胞凋亡及caspase-3的活化顯著減少，其凋亡率分別減少為T(mén)CP組的87.88%(1 μmol/L)、51.84%(5 μmol/L)和28.35%(20 μmol/L)(圖3、圖4，P<0.05)。

Fig. 3 Effects of bergapten on morphologic changes of apoptosis induced by TCP wear particles in osteocytes MLO-Y4 cells (Hoechst 33342, ×200)

TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

A： FCM for apoptosis caused by TCP wear particles in osteocytes MLO-Y4; B： Casp-3 activation examined by western blot; C： The percentage of apoptosis analyzed; TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

2.3 佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞功能損傷的影響

與Control組比較，TCP組骨細(xì)胞中DMP-1的RNA水平顯著減少，而SOST和FGF23的mRNA水平明顯增加，造成DMP-1/SOST減少(表2，P< 0.05)；與TCP組比較，佛手苷內(nèi)酯組骨細(xì)胞中DMP-1的mRNA水平明顯增加，SOST和FGF23的mRNA水平明顯減少，造成DMP-1/SOST顯著增加(表2，P<0.05)。

Tab. 2 Effects of bergapten on dysfunctions of osteocytes caused by TCP wear particles in MLO-Y4 cells n=3)

TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten; DMP-1: Dentin matrix protein1; SOST: Sclerostin; FGF23: Fibroblast growth factor 23.

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group;△P<0.05vsBP (1 μmol/L) group;▲P<0.05vsBP (5 μmol/L) group

2.4 佛手苷內(nèi)酯對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及PERK通路活化的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與Control組比較，TCP組骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及PERK信號(hào)通路被激活，表現(xiàn)為T(mén)CP組骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白質(zhì)GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4和CHOP等蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05，圖5)，p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α值也明顯減少。與TCP組比較，佛手苷內(nèi)酯組骨細(xì)胞中GRP78、ATF4和CHOP等蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)、p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α值也明顯增加(P<0.05，圖5)，且佛手苷內(nèi)酯對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和PERK通路的激活影響具有一定的劑量依賴(lài)性。

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是指用人工關(guān)節(jié)置換和代替損傷或病損關(guān)節(jié)，是臨床治療晚期髖、膝關(guān)節(jié)等嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病的重要手段，它可有效減輕患者關(guān)節(jié)疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，提高患者生活質(zhì)量。但是，隨著關(guān)節(jié)置換病例的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，假體晚期松動(dòng)問(wèn)題日益突出。大量研究表明，PE、Ti和TCP等三類(lèi)關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期磨損、碰撞產(chǎn)生大量的磨損顆粒，這些微米粒徑的細(xì)小顆粒聚集于假體表面會(huì)刺激假體周?chē)M織細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2，以上破骨細(xì)胞活化這些因子可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和假體周?chē)侨芙?，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體晚期松動(dòng)及人工關(guān)節(jié)置換失敗[1, 2]。

目前有關(guān)磨損顆粒對(duì)假體周?chē)奘杉?xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響研究較多，而對(duì)于假體周?chē)控S富的骨細(xì)胞在假體周?chē)侨芙獾淖饔醚芯窟€很少。2015年，Zawawi[14]研究團(tuán)隊(duì)利用小鼠顱骨溶解模型證實(shí)PE磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周?chē)羌?xì)胞凋亡，與人工全髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)假體周?chē)羌?xì)胞損傷情況一致。最近我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示TCP磨損顆粒植入小鼠顱骨矢狀縫初期假體周?chē)羌?xì)胞發(fā)生凋亡[4]，釋放TNF-α、IL-1β、SOST和RANKL從而促進(jìn)破骨細(xì)胞活化與骨溶解，且假體周?chē)羌?xì)胞凋亡先于破骨細(xì)胞的活化。另外，TCP磨損顆?？蓽p少假體周?chē)羌?xì)胞特征蛋白DMP-1的mRNA水平，增加SOST和FGF23的mRNA水平。而DMP-1正調(diào)控骨代謝，其表達(dá)降低可抑制新骨形成而誘導(dǎo)骨吸收；而SOST和FGF23是一種負(fù)性調(diào)節(jié)骨量因子，SOST和FGF23的表達(dá)增加容易造成破骨細(xì)胞性骨溶解[15, 16]。因此，DMP-1、SOST和FGF23的mRNA水平以及DMP-1/SOST變化可反映骨細(xì)胞功能損傷情況。以上研究結(jié)果表明，骨細(xì)胞是誘導(dǎo)假體周?chē)侨芙獾闹匾獑?dòng)者，而阻止假體周?chē)羌?xì)胞損傷及凋亡可防治磨損顆粒誘導(dǎo)假體周?chē)侨芙夂完P(guān)節(jié)松動(dòng)。

A: Activation of PERK/eIF2α signaling pathway examined by western blot; B, C, D, E and F: Densitometric analysis data;

GRP78: Glucose regulated protein 78; PERK: Phospho-protein kinase R-like ER kinase; p-PERK: Phospho-PERK; eIF2α: Eukaryotic initiation factor 2α; p-eIF2α: phospho-eIF2α; ATF4: Activating transcription factor 4; CHOP: C/EBP-homologous protein; TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

佛手苷內(nèi)酯是一種天然香豆素類(lèi)化合物，具有抗炎和抗腫瘤等活性[9-11]，臨床上也常用于白癜風(fēng)等皮膚病的治療。有報(bào)道顯示，佛手苷內(nèi)酯可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加新骨形成；另有研究認(rèn)為佛手苷內(nèi)酯能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞凋亡，阻止破骨細(xì)胞生成和骨吸收[12, 13]。本研究結(jié)果顯示佛手苷內(nèi)酯可顯著抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞MLO-Y4活性降低、減少細(xì)胞凋亡，上調(diào)DMP-1的mRNA水平，并下調(diào)SOST和FGF23的mRNA水平。這表明佛手苷內(nèi)酯可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)MLO-Y4細(xì)胞，使其免受TCP磨損顆粒的功能損傷。但是，其具體調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。

眾多研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控骨細(xì)胞凋亡[17, 18]，調(diào)節(jié)骨吸收疾病的發(fā)生和發(fā)展。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)合成后修飾和折疊的場(chǎng)所。缺氧、葡萄糖缺乏、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常及Ca2+耗竭等病理刺激均可誘導(dǎo)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量堆積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控包括PERK、肌醇需要酶-1( inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor 6，AFT6)等3條信號(hào)通路[19-21]。其中，PERK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。正常情況下，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，PERK與GRP78解離，解離后的PERK形成同源二聚體并發(fā)生自身磷酸化，活化的PERK使下游eIF2α發(fā)生磷酸化，抑制未折疊蛋白質(zhì)合成，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能而促進(jìn)細(xì)胞存活[22]。但是，當(dāng)發(fā)生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)強(qiáng)的ERS時(shí)，磷酸化的eIF2α可通過(guò)上調(diào)其下游ATF4和CHOP表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)佛手苷內(nèi)酯顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及PERK通路的活化，阻止骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡，表現(xiàn)為：與TCP組比較，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)GRP78、ATF4和CHOP的表達(dá)明顯下調(diào)，p-PERK/PERK值和p-eIF2α/p-eIF2α值顯著增加，與佛手苷內(nèi)酯對(duì)骨細(xì)胞凋亡的抑制作用基本一致(圖4)。然而，另外兩條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路IRE1和ATF6在佛手苷內(nèi)酯阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞損傷中所發(fā)揮的作用如何，還需要我們以后進(jìn)行深入的探討。

綜上，佛手苷內(nèi)酯可通過(guò)減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK通路活化而阻止骨細(xì)胞凋亡。因此，佛手苷內(nèi)酯有望成為防治假體周?chē)羌?xì)胞損傷及骨溶解的一種潛在藥物。