金錢魚Zar1基因克隆及其表達(dá)分析

何飛祥，江東能，陳華譜，鄧思平，吳天利，田昌緒，石紅娟，朱春華，李廣麗

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心 // 湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

脊椎動(dòng)物受精和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中存在卵母細(xì)胞特異的母源效應(yīng)基因（Maternal effect gene，MEG），此類基因通常特異表達(dá)于卵巢組織及卵母細(xì)胞中。其在母體型向合子型調(diào)控的過(guò)渡期發(fā)揮重要功能，該轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控過(guò)渡稱為母體-合子轉(zhuǎn)變或卵子-合子轉(zhuǎn)變（Maternal-zygotic transition, MZT）。至今，已在脊椎動(dòng)物中鑒定出多種母源效應(yīng)基因，包括Dnmt1、Gdf9、Bmp15、Mater、Zar1、Hsf1、Nalp5、Nalp9、Stella、Brg1、Nmp2、Fmn2、Basonuclin和Zfp36l2[1-3]。合子阻滯因子1（Zygote arrest 1，Zar1）是第一個(gè)在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)的卵子-合子轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用的母源效應(yīng)基因[4]。目前已在斑馬魚[3]、紅鰭東方鲀[5]、虹鱒[6]等魚類中開(kāi)展了Zar1克隆和表達(dá)分析。Zar1在不同物種中的組織表達(dá)模式不同，主要表達(dá)于性腺和胚胎發(fā)育細(xì)胞中。小鼠Zar1在卵母細(xì)胞、1和2細(xì)胞期的胚胎中表達(dá)[4]；斑馬魚Zar1僅在卵巢中高表達(dá)，有著明顯的卵巢特異性，在斑馬魚的卵母細(xì)胞和整個(gè)胚胎期均可檢測(cè)到Zar1轉(zhuǎn)錄本，而在囊胚期后表達(dá)下降[3]。

雌性小鼠中純合敲除Zar1，產(chǎn)生的卵子可正常受精而形成合子，但多數(shù)胚胎停留在1細(xì)胞期而無(wú)法受孕[4]。雌性斑馬魚中敲除Zar1后的突變體導(dǎo)致早期卵母細(xì)胞凋亡和性腺出現(xiàn)雄性化，發(fā)生由雌向雄的性別逆轉(zhuǎn)，表明Zar1對(duì)于早期卵子發(fā)生的必需[7]。因此，Zar1作為卵巢特異表達(dá)的母源效應(yīng)基因可能參與卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。

金錢魚（Scatophagus argus），隸屬鱸形目（Perciformes）金錢魚科（Scatophagidae）金錢魚屬（Scatophagus），廣泛分布于印度洋到太平洋海域，是廣鹽性亞熱帶硬骨魚[8]。它是一種具有觀賞和食用價(jià)值的名貴海水經(jīng)濟(jì)魚類。但是金錢魚的卵巢成熟比精巢晚，雌雄發(fā)育不同步，這導(dǎo)致其人工繁殖困難[9-10]。目前，在金錢魚的雌雄魚性別決定及其分化，以及生殖發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控方面已有較多研究報(bào)道[11-14]，而對(duì)于金錢魚在發(fā)育成熟之前的卵母細(xì)胞所特異的母源效應(yīng)基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)克隆金錢魚Zar1基因，分析該基因在各組織中的表達(dá)情況，以及它們?cè)诓煌韵侔l(fā)育時(shí)期和胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，為Zar1在金錢魚生殖發(fā)育過(guò)程中的生理功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金錢魚成魚購(gòu)自廣東省湛江市東風(fēng)水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，體質(zhì)量 200 ～ 350 g，體長(zhǎng) 16.0 ～ 22.6 cm。挑取健康的性發(fā)育成熟個(gè)體，剖取心臟、肝、脾、胃、腎、鰓、肌肉、腸、下丘腦、垂體和性腺組織于液氮中速凍，移至-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RNA提取及基因克隆、組織表達(dá)研究。另取部分卵巢組織用于其發(fā)育時(shí)期確定，雌魚每發(fā)育時(shí)期各取3尾，作為平行對(duì)照。不同發(fā)育時(shí)間胚胎樣本，從受精卵至出膜每1 h取樣1次，共對(duì)13個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行取樣3個(gè)，每個(gè)樣本各取20枚胚胎混合，受精卵或胚胎樣品采集時(shí)用DEPC（Sigma公司）水沖洗干凈。胚胎樣本為實(shí)驗(yàn)室保存[15]。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol試劑盒（Invitrogen）按參考說(shuō)明書提取性腺總RNA。用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，并用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo Scientific）檢測(cè)提取RNA濃度和純度，-80 ℃保存以備用。然后以1 μg RNA為模板，按照 Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 金錢魚Zar1基因克隆和序列分析

從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大黃魚（Larimichthys crocea）、歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的Zar1mRNA序列，將序列與本實(shí)驗(yàn)室金錢魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析[16]，找到金錢魚Zar1可能轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而分別設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成（表1）根據(jù)得到的金錢魚Zar1序列分別設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。采用2×PCR MIX試劑（東盛生物科技公司）進(jìn)行基因序列PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的片段用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化（N1072，東盛生物科技公司）。純化片段連接到 Peasy-T3載體（CT301，北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行亞克隆，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐的固體培養(yǎng)基于37 ℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。篩選陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線預(yù)測(cè)金錢魚Zar1的開(kāi)放閱讀框（ORF），并利用EditSeq軟件翻譯其對(duì)應(yīng)氨基酸序列。使用SMART（http://smart.embl－h(huán)eidelberg.de/smart/）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用Lasergene v 7.1.0軟件進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)和同源性分析。使用 Clustal X1.83和Mega 6.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR

取金錢魚各組織及卵巢不同發(fā)育時(shí)期的cDNA作為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）方法檢測(cè)金錢魚Zar1基因在雌雄魚各個(gè)組織及其不同發(fā)育時(shí)期卵巢的表達(dá)。β-actin基因作為內(nèi)參，引物如表1所示。用2×PCR MIX（東盛生物科技公司）在C1000TM Thermal Cycler（Bio Rad，美國(guó)）PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)32次（β-actin循環(huán)28次）；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用20 mg/m L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Tanon 2500R凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in present research

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)

使用Zar1基因的特異性qPCR引物見(jiàn)表1，在Roche light CyclerTM 96實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Roche）上進(jìn)行qPCR分析，檢測(cè)Zar1在卵巢和胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參基因。參照試劑盒說(shuō)明書 SYBR?Green Real Time PCR Master Mix (TOYOBO，QPK-201)進(jìn)行，反應(yīng)體系 20 μL 為：PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L），cDNA 模板 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共循環(huán)40次。運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算Zar1的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各個(gè)時(shí)期使用3個(gè)平行樣本。采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平α= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢魚Zar1序列分析

克隆得到金錢魚Zar1包含ORF的cDNA序列，ORF長(zhǎng)為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸（Genbank登錄號(hào)：MK736659）。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)ExPASy分析 Zar1蛋白的理化特性，其蛋白分子量為 38 436.54，理論等電點(diǎn)為 9.72，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為 41.94，疏水性平均值為-1.083，其脂溶系數(shù)為48.33。利用在線軟件對(duì) Zar1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），其氨基酸序列中α-螺旋占14.33%，β-轉(zhuǎn)角占3.28%，延伸鏈及無(wú)規(guī)則卷曲各占14.33%、68.06%。

2.2 Zar1基因同源性分析

將金錢魚Zar1氨基酸序列與人、小鼠、斑馬魚等其他物種蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖1），Zar1氨基酸的C末端序列非常保守，具有非典型的PHD 基序（Plant homeo domain）。其具有保守的C12結(jié)構(gòu)模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-C-X1-C-X17- C-X2-C-X6-C）。金錢魚 Zar1氨基酸序列中 236～321代表鋅結(jié)合域（zinc-binding domain），該結(jié)合域?qū)儆谝粋€(gè)具有多對(duì)CxxC基序的zf-3CxxC超家族成員，可能代表多個(gè)鋅結(jié)合區(qū)，有著半胱氨酸與高度保守的組氨酸殘基。將金錢魚Zar1氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對(duì)顯示，金錢魚Zar1與大黃魚同源性最高，為85.1%，與小鼠同源性最低，為38.0%（表2）。另外，將金錢魚Zar1氨基酸序列與其他脊椎物種的Zar1氨基酸序列進(jìn)行鄰接（neighbor-joining）聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。發(fā)現(xiàn)金錢魚與鱸形目的大黃魚聚為一支，同源性較高，其親緣關(guān)系最近。而與人、小鼠、斑馬魚和非洲爪蟾相分離，結(jié)果表明金錢魚在進(jìn)化上與鱸形目魚類親緣關(guān)系較近。

圖1 金錢魚Zar1與其他脊椎動(dòng)物氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.1 Comparison of Zar1 amino acid sequences between Scatophagus argus from other vertebrate

表2 金錢魚Zar1與其他物種的同源性分析Table 2 Homology analysis of Scatophagus argus Zar1 with other species

圖2 NJ法構(gòu)建金錢魚Zar1與其他脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Scatophagus argus Zar1 from other vertebrates based on NJ method

2.3 Zar1基因組織表達(dá)水平

通過(guò)RT-PCR方法分析Zar1在成年金錢魚的心臟、肝臟、脾、胃、腎、鰓、肌肉、腸、下丘腦、垂體、性腺各個(gè)組織中的表達(dá)水平。對(duì)照組β-actin在雌雄所有組織中均擴(kuò)增獲得相似亮度的條帶。Zar1僅在卵巢中強(qiáng)烈表達(dá), 獲得明顯的特異擴(kuò)增條帶, 且擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與目的片段相一致，但未在其他組織中檢測(cè)到特異擴(kuò)增條帶（圖3）。結(jié)果說(shuō)明金錢魚Zar1基因具有卵巢特異性表達(dá)的特征

2.4 金錢魚不同性腺發(fā)育時(shí)期Zar1基因表達(dá)水平

為進(jìn)一步驗(yàn)證Zar1基因在金錢魚卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，本研究使用 RT-PCR和 qPCR對(duì)金錢魚Zar1雌魚II期、III期和IV期的卵巢進(jìn)行表達(dá)定量分析（圖4）。

結(jié)果顯示，Zar1在卵巢中的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著遞增的趨勢(shì)，在 IV期卵巢中表達(dá)量達(dá)到最高。但 II期卵巢的相對(duì)表達(dá)量很微弱，與 IV期卵巢的表達(dá)水平形成顯著差異（P＜0.05）。

圖3 金錢魚Zar1在不同組織中的表達(dá)水平Fig.3 Zar1 expression in tissue of Scatophagus argus

圖4 金錢魚Zar1在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平Fig.4 Relative expression level of Zar1 at different ovary development stages in Scatophagus argus

2.5 Zar1在金錢魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平

金錢魚Zar1在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)結(jié)果顯示，該基因在各個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均有不同程度的表達(dá)（圖5）。從整體胚胎發(fā)育時(shí)期來(lái)看，隨著胚胎發(fā)育時(shí)期的變化，金錢魚Zar1的表達(dá)水平出現(xiàn)逐漸遞減的趨勢(shì)。在受精后的前 5 h，即原腸胚期之前，其表達(dá)量維持在較高水平。其中，在受精后1 h達(dá)到最高表達(dá)，即四細(xì)胞期。在受精后 3～5 h，即原腸胚期有顯微降低趨勢(shì)。6 h之后，即眼囊形成期呈現(xiàn)顯著的降低趨勢(shì)。之后則逐漸降低，直到孵化期一直維持在相對(duì)較低表達(dá)。在受精后15 h，即孵化期達(dá)到最低水平。

圖5 胚胎發(fā)育過(guò)程中金錢魚Zar1的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression level of Zar1 during embryonic development stages in Scatophagus argus

3 討論

本研究通過(guò)克隆獲得金錢魚Zar1基因ORF全長(zhǎng)1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸。金錢魚Zar1序列與其他物種進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，金錢魚Zar1與大多數(shù)魚類的序列同源性較高，而與哺乳類和爬行類物種的序列同源性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示金錢魚Zar1與大黃魚緊密聚為一支，與其他鱸形目進(jìn)化關(guān)系較為緊密，與傳統(tǒng)分類地位一致。金錢魚Zar1在C末端極其保守,具有非典型的PHD基序和鋅指結(jié)構(gòu)。其PHD基序具有保守的C12結(jié)構(gòu)模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-CX1-C-X17-C-X2-C-X6-C）。所有物種 Zar1的 PHD基序都是非典型的C12模式，而不是典型的C8模式[17]。研究表明，非典型的C12模式PHD基序在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中參與了與其它蛋白的相互作用，此外Zar1的PHD基序同樣含有鋅指結(jié)構(gòu)[18-19]。Zar1的非典型 PHD基序可能參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為金錢魚Zar1可能作為轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用。

金錢魚Zar1僅在金錢魚卵巢中表達(dá)，表明金錢魚Zar1是卵巢特異性表達(dá)基因。Zar1在有些物種也僅在卵巢中表達(dá)，如小鼠[5]、虹鱒[20]和斑馬魚[3]。而在有的物種中Zar1的組織表達(dá)范圍較廣，如Zar1在牛[21]、雞[17]和蛙[5]的卵巢之外的其他組織中也表達(dá)，包括肌肉、心臟、精巢等。目前，Zar1在不同物種組織表達(dá)差異的機(jī)制尚不清楚，有待后續(xù)研究。

金錢魚Zar1在卵巢各個(gè)時(shí)期均表達(dá)，且隨著卵母細(xì)胞的成熟逐漸升高。在斑馬魚中，Zar1在П到 IV期卵巢表達(dá)量都維持在較高的表達(dá)水平[3]。非洲爪蟾Zar1在卵子發(fā)生各個(gè)階段都表達(dá)，在卵子成熟過(guò)程穩(wěn)定表達(dá)[22]。結(jié)果說(shuō)明Zar1卵巢特異表達(dá)基因在卵子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，分析Zar1在金錢魚早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Zar1在受精后早期顯著表達(dá)，但在原腸胚期之后，出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這與母源效應(yīng)基因的表達(dá)特征相一致，即由母體向合子的過(guò)渡可以細(xì)分為兩個(gè)過(guò)程，在轉(zhuǎn)變前的母體基因表達(dá)量顯著，而轉(zhuǎn)變后，母體mRNA和蛋白質(zhì)逐漸降解而合子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程開(kāi)始[23]。在斑馬魚[3]、小鼠[4]中，Zar1在囊胚期到原腸胚期表達(dá)量顯著降低，之后保持在較低表達(dá)水平，非洲爪蟾Zar1的表達(dá)量在神經(jīng)胚期明顯下降[24]。由此可知，金錢魚Zar1可能參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育早期過(guò)程。

綜上，金錢魚Zar1作為一個(gè)重要的母源效應(yīng)基因，具有在卵巢中特異性表達(dá)的特征。其在卵母細(xì)胞到胚胎的過(guò)渡過(guò)程中充當(dāng)著重要角色，在卵子發(fā)育和胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。