5-脂氧合酶抑制劑Zileuton緩解壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)

鄧 偉 陳嬌嬌 魏 麗 吳青青 唐其柱

心肌重構(gòu)是高血壓病、冠心病、瓣膜病等多種心血管疾病發(fā)展為心力衰竭的關(guān)鍵病理生理過(guò)程。雖然現(xiàn)在對(duì)心力衰竭的治療由改善血流動(dòng)力學(xué)(強(qiáng)心利尿)進(jìn)展到系統(tǒng)治療(抑制神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)度激活，以及心臟再同步化輔助裝置等)，但心力衰竭的發(fā)生率和病死率仍居高不下[1]?！吨袊?guó)心力衰竭診斷與治療指南2014》明確指出，心力衰竭的治療目標(biāo)不僅是改善癥狀，提高生活質(zhì)量，更重要的是針對(duì)心肌重構(gòu)的機(jī)制，防止和延緩心肌重構(gòu)的發(fā)展，從而降低心力衰竭的病死率和住院率。因此，在目前各種治療策略已達(dá)到瓶頸的現(xiàn)狀下，探索新的、可能更有效的心肌重構(gòu)干預(yù)靶點(diǎn)，進(jìn)而遏制心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，顯得尤為迫切。

炎性因子及免疫信號(hào)通路在心肌重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用，但白三烯及其相關(guān)通路蛋白是否在心肌重構(gòu)中發(fā)揮了作用尚不清楚。5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是機(jī)體白三烯合成的關(guān)鍵酶，它通過(guò)經(jīng)典的免疫調(diào)控效應(yīng)在腫瘤、感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等多種疾病進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[2～5]。既往對(duì)5-LOX在心血管疾病中的作用研究集中在動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，但5-LOX對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的影響國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道[6, 7]。在本研究中，筆者應(yīng)用5-LOX抑制劑Zileuton干預(yù)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)，擬探討Zileuton對(duì)心肌重構(gòu)和心力衰竭的作用。

對(duì)象與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:C57BL/6J(C57)品系的野生型小鼠，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，選擇體重24～27g、8～10周齡的雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立心肌重構(gòu)小鼠模型，進(jìn)行觀察和研究。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(IVC)內(nèi)，自由進(jìn)食進(jìn)水，飲用水經(jīng)高壓處理，飼料經(jīng)60Co照射滅菌。系統(tǒng)環(huán)境為SPF級(jí)，溫度維持在22～24℃，濕度為50%～60%，12h明暗交替。實(shí)驗(yàn)分4組：假手術(shù)組(Sham組)包括對(duì)照組(Sham-Veh組)和Zileuton干預(yù)組(Sham-Zil組)，心肌重構(gòu)模型組(AB組)也包括對(duì)照組(AB-Veh組)和Zileuton干預(yù)組(AB-Zil組),每組20只小鼠。

2.心肌重構(gòu)動(dòng)物模型制作及干預(yù)方法:制作壓力負(fù)荷性左心室心肌重構(gòu)小鼠模型(AB模型組)：經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開(kāi)皮膚，依次分離肌肉及軟組織，游離胸主動(dòng)脈，將7-0手術(shù)縫線穿過(guò)主動(dòng)脈，將去尖的27號(hào)針頭連同主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后立即抽出針頭，造成主動(dòng)脈70% 狹窄后，逐層縫合切口。假手術(shù)組只在分離主動(dòng)脈后穿過(guò)一條短絲線，不作結(jié)扎，其他手術(shù)步驟同模型組。

Zileuton購(gòu)自南京康滿林生物科技有限公司，純度98%，每次使用前用0.5%羧甲基纖維素溶液制成新鮮懸液。藥物干預(yù)組Zileuton 70mg/kg灌胃，每天1次，術(shù)后1周開(kāi)始，持續(xù)至術(shù)后7周取材，對(duì)照組同時(shí)給予等容量溶媒灌胃。

3.心臟超聲檢測(cè):術(shù)后8周做心臟超聲檢測(cè)。異氟烷吸入性麻醉小鼠，將小鼠左胸前區(qū)剃毛，涂抹耦合劑，取左側(cè)臥位或仰臥位對(duì)小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀(My lab 30，意大利Esaote公司), 頻率為15MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測(cè)量小鼠心率(HR)、舒張末期左心室內(nèi)徑(LVEDD)、左心室后壁厚度(LVPWD)、室間隔厚度(IVSD)、射血分?jǐn)?shù)(EF)。每組小鼠采集10只小鼠的數(shù)據(jù)。

4.組織病理學(xué)檢測(cè)：術(shù)后8周取材。取出心臟和肺臟，用濾紙吸干血液后分別稱重，計(jì)算心臟重量與體重的比值(HW/BW)，肺臟重量與體重的比值(LW/BW)。每組各取8個(gè)心臟加入10倍量4%多聚甲醛固定后24h后, 將小鼠心臟放于翻拍板上用照相機(jī)(尼康D700)拍大體心臟。將拍完后的心臟脫水、石蠟包埋、切片。其中部分組織切片(n=8)留作心肌膠原天狼星紅染色；另一部分組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色(n=8)。

結(jié) 果

1.Zileuton抑制了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)和心功能下降:超聲結(jié)果顯示，Zileuton干預(yù)使AB-Zil組小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)下降程度較AB-Veh組明顯緩解，并抑制了舒張末期室間隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd)的增加，同時(shí)使左心室舒張末內(nèi)徑(LVDd)縮小，改善了由壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)和心功能下降(圖1，圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠心臟超聲影像比較

圖2 Zileuton干預(yù)對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠左心室結(jié)構(gòu)和心功能改變的影響與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=10

2.Zileuton改善了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化:取材結(jié)果顯示，Zileuton干預(yù)的心肌重構(gòu)模型組(AB-Zil組)小鼠心重、肺重、心重/體重比，肺重/體重比均較對(duì)照組(AB-Veh組)小鼠減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)各組小鼠體重沒(méi)有明顯差異(圖3)。病理學(xué)檢測(cè)顯示，Zileuton明顯緩解了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)，包括心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化(圖4)。

圖3 Zileuton干預(yù)對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠心重和肺重變化的影響與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=15

圖4 病理學(xué)大體觀察以及左心室HE染色(×400)和天狼星紅染色(×200)結(jié)果與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=8

討 論

在本項(xiàng)研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，5-LOX特異性抑制劑Zileuton能夠抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)和心功能下降，包括改善射血分?jǐn)?shù)，使舒張末期左心室擴(kuò)大程度減少，緩解了舒張末期室間隔和左心室后壁的增厚。Zileuton對(duì)心肌重構(gòu)的抑制作用通過(guò)取材結(jié)果得到進(jìn)一步證實(shí)，Zileuton干預(yù)組小鼠心重、肺重、心重/體重比、肺重/體重比均較對(duì)照組小鼠減輕。心肌HE染色和天狼星紅染色也顯示Zileuton使單個(gè)心肌細(xì)胞橫截面積和心肌組織膠原沉積的增加均被抑制。

5-LOX屬于氧化還原酶，是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，其經(jīng)典作用是白三烯(leukotrienes，LTs)合成的限速酶[4]。細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶的作用下生成花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，5-LOX催化花生四烯酸氧化生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物5-羥基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosate-traenoic acid，5-HETE)；隨后，5-HETE繼續(xù)在5-LOX催化下，生成 LTA4；不穩(wěn)定的LTA4在LTA4水解酶作用下形成LTB4(leukotriene B4，LTB4)，在LTC4合成酶作用下形成白三烯C4(leukotriene C4，LTC4)，LTC4被主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞后，在α-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的作用下轉(zhuǎn)化為白三烯D4(1eukotriene D4，LTD4)，LTD4再進(jìn)一步代謝為白三烯E4(1eukotriene E4，LTE4)[8]。LTB4、LTC4、LTD4、LTE4均為白三烯家族成員，作為趨化因子參與免疫應(yīng)答。

此外，5-LOX能夠促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，激活相關(guān)信號(hào)通路，加重組織氧化應(yīng)激損傷，加速疾病發(fā)展[9～11]。高濃度的高金雀花堿能夠激活原代肌細(xì)胞的5-LOX，使胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，同時(shí)NADPH氧化酶表達(dá)上調(diào)，Zileuton能夠增加胞內(nèi)N-乙酰半胱氨酸的生成而減少高金雀花堿誘導(dǎo)的ROS增加，緩解原代肌細(xì)胞損傷[12]。同時(shí)，5-LOX參與了多種疾病的組織纖維化[13, 14]。芳香烴受體的配體TCDD通過(guò)激活5-LOX增加了人原代肺纖維母細(xì)胞系HFL-1和CCL-202細(xì)胞的遷移和分化，同時(shí)成纖維細(xì)胞分化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)增加，而選擇性5-LOX抑制劑和芳香烴受體特異性拮抗劑CH223191均能夠減少HFL-1和CCL-202細(xì)胞的遷移和增殖以及α-SMA表達(dá)，從而緩解肺纖維化[15]。

Zileuton是通過(guò)抑制白三烯生成，抑制炎性及免疫信號(hào)通路，或者是通過(guò)改善心肌重構(gòu)過(guò)程中過(guò)度激活的氧化應(yīng)激，從而抑制心肌重構(gòu)和改善心功能，目前并不清楚，需要進(jìn)一步探索。但從已得到的表型數(shù)據(jù)顯示，5-LOX有可能成為抑制心肌重構(gòu)、防治心力衰竭的新靶點(diǎn)。