短期生物炭添加對(duì)不同類型土壤細(xì)菌和氨氧化微生物的影響

張夢(mèng)陽，夏浩，呂波，叢銘，宋文群，姜存?zhèn)}

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短期生物炭添加對(duì)不同類型土壤細(xì)菌和氨氧化微生物的影響

張夢(mèng)陽1，夏浩1，呂波1，叢銘1，宋文群2，姜存?zhèn)}1

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微量元素研究中心，武漢 430070；2江西省信豐縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，江西贛州 341600）

【目的】氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是硝化作用的限速步驟，是全球氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)旨在研究在我國不同類型土壤中添加花生殼生物炭對(duì)細(xì)菌和氨氧化作用的影響，為生物炭的推廣使用提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭囼?yàn)以黃棕壤、潮土、黑土為供試土壤，通過短期培養(yǎng)試驗(yàn)，利用16SrRNA測(cè)序研究生物炭對(duì)不同類型土壤氨氧化微生物、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響。每種土壤設(shè)置4個(gè)處理：CK（不施用化肥和生物炭），F(xiàn)（單施化肥），C（單施2%花生殼生物炭），F(xiàn)C（施用化肥+2%花生殼生物炭）?！窘Y(jié)果】施用生物炭后（C、FC）酸性土壤pH顯著提高了0.5—1.0個(gè)單位，但堿性土壤pH顯著降低了0.5—0.6個(gè)單位；單施生物炭（C）造成黃棕壤的微生物豐富度和多樣性顯著提高，潮土在單施生物炭（C）時(shí)僅顯著提高了土壤的微生物多樣性指數(shù)，在黑土中施用生物炭和化肥都未顯著改變土壤微生物的豐富度和多樣性；在3種土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度皆高于氨氧化古菌，測(cè)得的氨氧化細(xì)菌的OTU豐度約為氨氧化古菌的8.1倍；生物炭和化肥并未顯著改變奇古菌門中的OTU豐度，卻對(duì)β和γ變形菌中的OTU豐度產(chǎn)生了顯著性影響；3種土壤的氨氧化細(xì)菌都以β變形菌為主，約占60%；另外，生物炭的施用（C、FC）在PC1（40.4%）上顯著改變了黃棕壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，在PC1（42.3%）和PC2（21.3%）上都顯著改變了潮土的微生物群落結(jié)構(gòu)；施用生物炭后（C、FC），短期內(nèi)潮土中氨合成相關(guān)酶基因表達(dá)量顯著降低14.7%—39.9%，氨氧化古菌豐度在單一施炭（C）和化肥與生物炭同施（FC）時(shí)分別降低了70.5%和48.7%。【結(jié)論】施用生物炭后，短期內(nèi)顯著改變了黃棕壤和潮土的微生物群落結(jié)構(gòu)，并明顯抑制了潮土的氨氧化作用。

生物炭；化肥；氨氧化作用；微生物群落結(jié)構(gòu)；黃棕壤；潮土；黑土

0 引言

【研究意義】氮是組成生命最重要物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)必不可少的元素之一[1]，土壤圈是氮循環(huán)中最活躍的區(qū)域，土壤中氮循環(huán)對(duì)土壤質(zhì)量、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力乃至其他地球化學(xué)循環(huán)都有著重要的作用，而微生物是必不可少的推動(dòng)者[2-3]。生物炭近年來被廣泛應(yīng)用于改良土壤、提高土壤固炭能力等[4]，但生物炭施用于不同土壤時(shí)改良效果不同[5]，生物炭在土壤中的具體微生物效應(yīng)也不明確。因此，研究生物炭對(duì)不同類型土壤微生物群落和氨氧化作用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物炭作為一種土壤改良劑，鄭瑞倫等[6]的研究表明，400℃熱解得到的秸稈炭施用于壤土中顯著改善土壤pH、通氣性、含水量、有效養(yǎng)分等。李昌見等[7]通過大田試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)施用10 t·hm-2到60 t·hm-2玉米秸稈炭都顯著提高了砂壤土的含水量、肥料利用率。呂波等[8]施加3%生物炭后發(fā)現(xiàn)紅壤和黃棕壤的pH、速效養(yǎng)分以及酶活性都得到顯著提高。應(yīng)介官等[9]研究也表明在紅壤中添加生物炭可以顯著降低土壤鋁毒。相應(yīng)研究也證明了在不同溫度下熱解得到的生物炭都不同程度降低營養(yǎng)物質(zhì)的淋失，ASADA等[10-11]研究表明，低溫（400—500℃）熱解產(chǎn)生的毛竹生物炭有更強(qiáng)的NH3吸附能力。CLOUGH等[12]發(fā)現(xiàn)，高于600℃熱解產(chǎn)生的木材生物炭才具有較好的NO3-吸附能力。前人研究也發(fā)現(xiàn)生物炭的施用也與溫室氣體的排放有關(guān)，有學(xué)者利用9種不同原料經(jīng)500℃熱解得到的生物炭，研究了它們?cè)?4種不同類型土壤中N2O的排放，結(jié)果表明施用生物炭提高了土壤pH，從而減少土壤中N2O的排放[13]，但也有研究發(fā)現(xiàn)施用600℃熱解得到的木質(zhì)生物炭對(duì)草地土壤N2O排放無影響[12]，甚至有研究者發(fā)現(xiàn)無論是高溫（900℃）生產(chǎn)的核桃炭還是中溫（550℃）生產(chǎn)松木炭都促進(jìn)砂質(zhì)黏壤土N2O的排放[14]。氨氧化作用為硝化作用的限速步驟，該作用主要由氨氧化微生物推動(dòng)，氨氧化細(xì)菌廣泛的分布在土壤生態(tài)系統(tǒng)、淡水生態(tài)系統(tǒng)和海洋生態(tài)系統(tǒng)中，且氨氧化細(xì)菌主要屬于β變形菌綱和γ變形菌綱[15-16]。氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)讓我們了解到參與氨氧化作用的不僅有細(xì)菌還有古菌。最初，人們認(rèn)為氨氧化古菌隸屬于溫泉古菌（Crenarchaeota）[17]，BrochierArmanet等[18]研究并提出了新的古菌菌門奇古菌門（Thaumarchaeota）。也有研究證明奇古菌幾乎包括了所有發(fā)現(xiàn)的土壤、海洋、熱泉中的氨氧化古菌[19]。目前來看，生物炭對(duì)土壤氮循環(huán)的影響已開展較多研究，并發(fā)現(xiàn)生物炭的添加可能影響著氮素淋溶、氨揮發(fā)、硝化作用、固氮作用、以及氧化亞氮的產(chǎn)生[20-24]，微生物驅(qū)動(dòng)土壤氮循環(huán)的各過程[2-3]。我們可以明確土壤類型差異是導(dǎo)致生物炭施用效果差異產(chǎn)生的主要原因之一。ABUJABHAH等[25]也發(fā)現(xiàn)熱解溫度為650—750℃的桉樹生物炭對(duì)土壤微生物群落和氮循環(huán)細(xì)菌的影響主要取決于土壤類型，其中對(duì)紅壤和黑土的作用明顯高于棕壤。LIU等[26]施用了0—40 t·hm-2的稻殼生物炭（400℃）于紅壤、棕壤和鹽漬土中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物炭對(duì)紅壤細(xì)菌群落改變最顯著。【本研究切入點(diǎn)】在不同土壤中驅(qū)動(dòng)土壤氨氧化作用的主要微生物可能是氨氧化細(xì)菌也可能是氨氧化古菌，但生物炭的添加究竟是改變了土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度還是氨氧化古菌的豐度；在不同土壤施用生物炭后氨氧化微生物的變化趨勢(shì)是否相同；生物炭對(duì)酸堿性不同的土壤造成的氨氧化微生物的具體差異是否相同，很多類似的問題仍沒有明確的答案?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文選取我國3種不同類型土壤（黃棕壤、潮土、黑土）為供試土壤，通過16S rRNA測(cè)序分析得到單一施炭、單一施肥、生物炭與化肥同施對(duì)不同類型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、氨氧化微生物豐度以及氮代謝通路中相關(guān)酶基因表達(dá)量的具體差異，從而揭示生物炭對(duì)不同土壤細(xì)菌群落和氨氧化作用的具體影響，為生物炭的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及試驗(yàn)處理

試驗(yàn)土壤采集湖北黃棕壤、山東潮土、黑龍江黑土，每個(gè)地區(qū)選擇100 m2的區(qū)域，在區(qū)域中隨機(jī)選擇10個(gè)采樣點(diǎn)采集0—20 cm土層的土壤樣品，分別代表酸性、弱酸性和堿性土壤（供試土壤基本性質(zhì)見表1）。樣品自然風(fēng)干后挑去石子、植物根系等雜物，全部研磨過2 mm篩，混勻后儲(chǔ)存?zhèn)溆?。設(shè)4個(gè)處理：CK（不施用化肥和生物炭），F(xiàn)（單施化肥），C（單施生物炭），F(xiàn)C（施用化肥+生物炭）?；瘜W(xué)肥料施用KH2PO4，KNO3，NH4NO3和Ca(NO3)2（其中N 0.46 g·kg-1干土，P2O50.07 g·kg-1干土，K2O 0.24 g·kg-1干土）。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供花生殼生物炭，生物炭在400℃下熱解制備而成，全炭321.9 g·kg-1，全氮18.8 g·kg-1，全磷2.6 g·kg-1，全鉀8.5 g·kg-1，生物炭施用量為2%（生物炭質(zhì)量/土壤質(zhì)量）。試驗(yàn)在塑料杯中進(jìn)行培養(yǎng)，每杯裝土300 g，根據(jù)試驗(yàn)方案加入化肥和生物炭并混勻，土壤上層平鋪一層濾紙防止?jié)菜畷r(shí)擾動(dòng)土壤，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，試驗(yàn)過程中土壤持水量保持在40%左右。土壤與肥料和生物炭按處理混勻后加水至飽和持水量，靜置熟化1周，熟化后培養(yǎng)4周，試驗(yàn)于2018年5月6日至6月1日在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后采集新鮮土壤于-80℃保存用于DNA的提取以及測(cè)定，其余土壤自然風(fēng)干后，過1 mm篩，用于測(cè)定土壤pH（液土比例為2.5﹕1）。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.2 DNA 抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用515F（5′-GT GCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 Illumina Miseq測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接[27]：

（1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；

（2）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)overlap之間的最大錯(cuò)配率為0.2，長度需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

（3）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個(gè)樣本，barcode需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配,去除存在模糊堿基的序列。

本研究使用UPARSE軟件（version 7.1 http:// drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體[28]。利用RDP classifier （http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silv128/16S數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對(duì)閾值為70%[29]。分析所用序列為原始序列按照最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平后得到。文章中物種組成柱狀圖基于tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R語言工具作圖，用于分析處理間物種組成差異，物種豐度＜0.005合并為Other；Alpha多樣性指數(shù)利用mothur（version v.1.30.1 http://www.mothur.org/ wiki/ Schloss_SOP#Alpha_diversity）指數(shù)分析[30]，指數(shù)組間差異檢驗(yàn)方法采用Student’s T檢驗(yàn)。β多樣性利用R語言PCA統(tǒng)計(jì)分析和作圖。16S功能預(yù)測(cè)通過PICRUSt去除16S marker gene在物種基因組中的copy數(shù)目的影響，通過比對(duì)KEGG獲得代謝通路中的各個(gè)層級(jí)的代謝信息以及相關(guān)酶的基因表達(dá)量[31]。

采用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差和多因素分析，ANOVA進(jìn)行顯著性差異比較，多重比較采用Duncan檢驗(yàn)，所有數(shù)值均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 生物炭對(duì)不同土壤pH的影響

圖1所示，在黃棕壤中施用生物炭后顯著提升了其土壤的pH，提升了0.6—1.0個(gè)單位，然而單一施用化肥并未產(chǎn)生顯著性差異。在潮土中施用生物炭pH提升了0.5—0.6個(gè)單位，而僅施用化肥時(shí)降低了0.3個(gè)單位。在黑土中，與CK相比，無論是施用生物炭還是化肥都造成了土壤pH的顯著降低，降幅為0.2—0.6個(gè)單位。通過三因素方差分析發(fā)現(xiàn)，無論單一施肥、單一施炭還是生物炭與化肥同施都對(duì)土壤pH產(chǎn)生顯著影響，另外三因素兩兩間的交互效應(yīng)也對(duì)土壤pH存在顯著影響，但三因素間的交互效應(yīng)并無顯著影響（表2）。

YB：黃棕壤；FA：潮土；B：黑土。CK，F(xiàn)，C，F(xiàn)C分別代表對(duì)照，單施化肥，單施生物炭和生物炭與化肥同施4種處理。圖柱上不同字母表示在處理間存在顯著差異（P＜0.05）。下同

表2 土壤pH三因素方差分析

2.2 生物炭對(duì)不同土壤細(xì)菌、古菌豐富度和多樣性指數(shù)的影響

本研究采用Ace指數(shù)和shannon指數(shù)表示微生物豐富度指數(shù)以及多樣性指數(shù)，與對(duì)照相比分析經(jīng)化肥或生物炭處理后的指數(shù)變化（圖2）。在黃棕壤中單施生物炭提升了土壤細(xì)菌和古菌的豐富度和多樣性，且與對(duì)照、單施化肥處理之間存在顯著性差異，單施化肥降低了黃棕壤的豐富度和均勻度指數(shù)，但無顯著性差異，經(jīng)炭肥同施后也并未出現(xiàn)顯著變化（圖2-a,圖2-b）。在潮土中，單施化肥降低了土壤細(xì)菌和古菌的豐富度和多樣性，但僅在豐富度指數(shù)上存在顯著性差異，單施生物炭后細(xì)菌和古菌的多樣性指數(shù)得到顯著提升，生物炭與化肥同施后細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性指數(shù)變化幅度均較?。▓D2-c，2-d）。在黑土中，不同處理對(duì)土壤細(xì)菌和古菌豐富度和多樣性指數(shù)未出現(xiàn)顯著性改變（圖2-e，2-f）。

2.3 生物炭對(duì)不同土壤氨氧化微生物豐度的影響

通過分析測(cè)序所得氨氧化微生物的OTU豐度發(fā)現(xiàn)，無論是在黃棕壤還是在潮土和黑土中，氨氧化細(xì)菌的OTU豐度遠(yuǎn)大于氨氧化古菌的OTU豐度。另外，氨氧化古菌經(jīng)處理后測(cè)得的OTU豐度差異性不顯著，而氨氧化細(xì)菌在處理后則出現(xiàn)了顯著性差異（表3）。

*代表在0.05水平下差異顯著，**代表在0.01水平下差異顯著

表3 氨氧化微生物OTU豐度

為進(jìn)一步了解土壤中氨氧化微生物豐度的變化趨勢(shì)，針對(duì)古菌中的奇古菌和細(xì)菌中的β變形菌和γ變形菌的豐度變化進(jìn)行了分析（圖3）。結(jié)果顯示，在黃棕壤氨氧化古菌豐度變化上，奇古菌門在單施化肥和單施生物炭后分別提升了約81.8%和45.6%，但在生物炭與化肥同施時(shí)，其豐度下降了約15.0%（圖3-a）。在氨氧化細(xì)菌豐度變化上，主要以β變形菌為主，約占92.3%。β和γ變形菌之和以生物炭與化肥同施處理最高，與對(duì)照相比提高了14.8%，而單施生物炭卻降低了18.0%（圖3-b）。在潮土中，所有處理對(duì)土壤奇古菌門的豐度均存在降低作用，其中施炭處理（F和FC）的降低趨勢(shì)最明顯，分別降低了70.5%和48.7%（圖3-c）。另外，潮土中氨氧化細(xì)菌主要以β變形菌為主（圖3-d）。與潮土不同的是，黑土中所有處理對(duì)奇古菌門的豐度都存在提升趨勢(shì)，其中施炭處理（F和FC）提升最明顯，分別提高了66.7%和48.1%（圖3-e）。在氨氧化細(xì)菌方面，雖然黑土也以β變形菌為主，但是γ變形菌的豐度比例遠(yuǎn)高于其余潮土和黃棕壤。另外，在炭肥同施時(shí)黑土中氨氧化細(xì)菌的豐度也出現(xiàn)較大幅度的升高（圖3-f）。

2.4 生物炭對(duì)不同土壤細(xì)菌、古菌群落結(jié)構(gòu)的作用

通過主成分分析細(xì)菌和古菌的β多樣性，進(jìn)一步探究各處理間群落結(jié)構(gòu)的差異（圖4）。在黃棕壤中，單施化肥樣本點(diǎn)與對(duì)照樣本點(diǎn)分離程度較低，表明單施化肥對(duì)土壤的細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)影響較小。施炭處理（C和FC）與對(duì)照在X軸（40.4%）上存在明顯分離，另外單施炭和炭肥同施在Y軸（19.5%）上也存在明顯的分離（圖4-a）。在潮土中，施炭處理（C和FC）樣本點(diǎn)皆分布在第四象限，與對(duì)照處理在X軸（42.3%）和Y軸（21.3%）上都存在明顯分離（圖4-b）。在黑土中，對(duì)照、單施化肥以及炭肥同施三者之間沒有出現(xiàn)明顯的分離，但是單施化肥樣本點(diǎn)與對(duì)照樣本點(diǎn)間距離相對(duì)較遠(yuǎn)，說明在黑土中單施化肥對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對(duì)較大（圖4-c）。

圖3 不同土壤各處理間奇古菌，β變形菌和γ變形菌的豐度變化柱狀圖

圖4 不同土壤各處理間主成分分析

2.5 生物炭對(duì)土壤氨合成相關(guān)酶和氨氧化作用相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響

土壤中氮素循環(huán)過程中需要通過各個(gè)支路中各種各樣的酶相互協(xié)調(diào)完成（圖5，數(shù)據(jù)網(wǎng)址：http://www. genome.jp/kegg/pathway.html）。根據(jù)氮素代謝通路豐度表可以發(fā)現(xiàn)，黃棕壤和黑土經(jīng)化肥或生物炭處理后氮素代謝通路豐度并未發(fā)生顯著性改變，但在潮土中添加生物炭后氮素代謝通路豐度出現(xiàn)顯著性降低（表4）。

圖5 KEGG氮素代謝通路

表4 不同土壤各處理的氮代謝通路豐度

根據(jù)氮素代謝通路圖可以得到與氮素代謝相關(guān)酶和基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫得到一些與氨合成和氨氧化作用相關(guān)酶的相關(guān)表達(dá)（表5）。分析氮素代謝通路中相關(guān)酶基因表達(dá)量，研究在不同土壤不同處理中相關(guān)酶的變化情況，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的酶在黑土中出現(xiàn)變化的較少，只有甲酰胺酶（1.7.2.1）和腈水解酶（3.5.1.49）在處理間存在顯著差異。然而在黃棕壤和潮土中存在顯著差異的酶數(shù)量明顯多于黑土，且不同土壤間經(jīng)化肥或生物炭處理后出現(xiàn)顯著性差異的酶的種類也存在明顯區(qū)別。

黃棕壤中，經(jīng)化肥或生物炭處理后，與對(duì)照相比，氨合成和氨氧化作用相關(guān)酶的基因表達(dá)量有不同程度的改變，但均未達(dá)到顯著差異。在潮土中，生物炭的施用（F、FC）顯著降低了谷氨酸脫氫酶（2.7.2.2），谷氨酸脫氫酶（NAD（P）+）（1.4.1.2），谷氨酸脫氫酶（NADP+）（1.4.1.3）的表達(dá)量，另外，單施化肥也顯著降低了谷氨酸脫氫酶（NADP+）（1.4.1.3）的表達(dá)量，但會(huì)顯著提升亞硝酸還原酶（不分解）（1.4.1.4）的基因表達(dá)量。在黑土中經(jīng)不同處理后基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著性變化的酶種類較少，甲酰胺酶（1.7.2.1）在炭肥同施時(shí)表達(dá)量顯著提升，而氰酸裂合酶（3.5.5.1）在單施生物炭時(shí)表達(dá)量顯著下降。

表5 土壤氨合成相關(guān)酶和氨氧化作用相關(guān)酶基因表達(dá)量

3 討論

在本研究中酸性土壤施用生物炭后pH顯著提高了0.6—1.0個(gè)單位，但酸性土壤的氨氧化作用不僅未發(fā)現(xiàn)顯著提高，還出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，黃棕壤氮代謝通路豐度約降低了8.4%，而潮土中奇古菌的豐度約降低了70.5%，氮代謝通路豐度也顯著降低了7.8%，其中在潮土中呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，這或許是因?yàn)楸驹囼?yàn)培養(yǎng)時(shí)間較短。另外，土壤pH是影響氨氧化過程相關(guān)氨氧化微生物組成及群落結(jié)構(gòu)的重要因素[32]，在本研究中，這3種土壤中測(cè)得β變形菌和γ變形菌數(shù)量遠(yuǎn)高于奇古菌數(shù)量，表明細(xì)菌在這三種土壤的氨氧化作用中占主導(dǎo)地位。很多研究都表明大多數(shù)酸性土壤中，氨氧化古菌的數(shù)量要高于氨氧化細(xì)菌，因?yàn)榘毖趸啪鷮?duì)低pH有更強(qiáng)的適應(yīng)能力[33-36]。本試驗(yàn)采用的3種土壤分別為酸性，弱酸性以及堿性土壤，單施化肥對(duì)土壤pH的影響比生物炭弱，生物炭的添加顯著提升了酸性土壤的pH，但是土壤依舊呈酸性，而黑土在施用生物炭后顯著降低了pH，但土壤也仍呈堿性，在本研究中并未發(fā)現(xiàn)酸性土壤中奇古菌占優(yōu)勢(shì)。這可能與515F和806R作為測(cè)序引物有關(guān)，該引物可以用于鑒定細(xì)菌和古菌，但是更偏向于細(xì)菌鑒定[37]，或許在古菌的鑒定上存在一定偏差。

ABUJABHAH等[25]認(rèn)為熱解溫度為650—750℃的桉樹生物炭對(duì)土壤微生物群落和氮循環(huán)細(xì)菌的影響主要取決于土壤類型，其中對(duì)施用于紅壤時(shí)作用明顯高于棕壤。LIU等[26]施用了0—40 t·hm-2的稻殼生物炭（400℃）于紅壤、棕壤和鹽漬土中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物炭對(duì)紅壤細(xì)菌群落改變最顯著。通過我們的研究也發(fā)現(xiàn)，花生殼生物炭對(duì)黃棕壤和潮土的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響更明顯，這表明生物炭對(duì)偏酸性土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在更顯著的作用，主要原因是生物炭顯著提高了酸性土壤的pH，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落發(fā)生顯著改變。很多生物炭研究圍繞不同土壤氨氧化微生物的改變得到了不同的結(jié)果。HE等[38]發(fā)現(xiàn)熱解溫度為500℃的稻殼生物炭不會(huì)對(duì)堿性土壤產(chǎn)生顯著影響，但會(huì)改變酸性土壤的氨氧化微生物豐度。李雙雙等[39]在黃棕壤中施用熱解溫度為500℃的小麥秸稈炭發(fā)現(xiàn)單獨(dú)施用生物炭顯著降低了氨氧化細(xì)菌的豐度。也有相應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)墾土壤中施用400—500℃熱解成的小麥秸稈生物炭會(huì)提高土壤氨氧化細(xì)菌和古菌的豐度，并且氨氧化細(xì)菌的豐度還會(huì)隨著生物炭用量的增加而增加[40]。我們的研究結(jié)果與之不同，我們發(fā)現(xiàn)生物炭的施用主要降低酸性土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度，研究結(jié)果間的差異主要與土壤類型有關(guān)。BI等[41]在砂壤土中僅施用在600℃下熱解得到的稻草炭后發(fā)現(xiàn)并未顯著影響土壤氨氧化微生物，WU等[42]也在砂壤土上進(jìn)行了玉米芯生物炭的試驗(yàn)，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)僅施用生物炭并未顯著改變氨氧化微生物的組成。結(jié)合前人的研究和本試驗(yàn)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，生物炭對(duì)土壤微生物的影響，因炭而異，因土而異，在使用生物炭的時(shí)候應(yīng)考慮生物炭類型和土壤類型。同時(shí)也有研究者發(fā)現(xiàn)長期添加生物炭和短期施用生物炭的土壤中微生物群落存在明顯差異[43-44]。本研究周期相對(duì)較短，與長期試驗(yàn)結(jié)果是否一致有待進(jìn)一步探討。

有研究認(rèn)為土壤微生物群落對(duì)化肥的投入以及土壤營養(yǎng)條件的改變十分敏感[45]，但在不同報(bào)道中的結(jié)果差異很大且沒有清晰的趨勢(shì)，有研究表明肥料的施用與否對(duì)細(xì)菌群落無顯著影響[46-47]，但也有研究表明施肥導(dǎo)致了微生物群落組成的改變[48-49]。本研究中，單施化肥時(shí)并未發(fā)現(xiàn)黃棕壤、潮土、黑土出現(xiàn)顯著性差異。這與GEISSELER等[50]的研究結(jié)果相似，他發(fā)現(xiàn)絕大部分研究中土壤主要的微生物群落并沒有因?yàn)榛实氖┯枚a(chǎn)生明顯的改變。同樣在Ultuna 和Broadbalk 的冬小麥試驗(yàn)中，化肥與不施肥處理相比較，細(xì)菌的群落組成并沒有顯著的差異[46-47,51]。

4 結(jié)論

在土壤氨氧化作用中，黃棕壤、潮土和黑土都表現(xiàn)為氨氧化細(xì)菌占主導(dǎo)地位。生物炭的添加在短期內(nèi)會(huì)對(duì)黃棕壤及潮土的細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。施用生物炭后，在短期內(nèi)潮土的合成氨相關(guān)酶基因表達(dá)量顯著降低，氨氧化古菌豐度也明顯降低，從而抑制了氨氧化作用；化肥和生物炭對(duì)黃棕壤和黑土的氨氧化作用也存在一定程度的影響。

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Short-term Effect of Biochar Amendments on Total Bacteria and Ammonia Oxidizers Communities in Different Type Soils

ZHANG MengYang1, XIA Hao1, Lü Bo1, CONG Ming1, SONG WenQun2, JIANG CunCang1

(1Microelement Research Center, College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070;2Xinfeng’s Agricultural Technology Promotion Station, Ganzhou 341600, Jiangxi)

【Objective】Ammonia oxidation is the first step in nitrification and the rate-limiting step in nitrification. It is a key link in the global nitrogen cycle. The purpose of this experiment was to study the effects of peanut shell biochar application on bacteria and ammonia oxidation in different type soils in China, so as to provide a theoretical basis for the promotion and use of biochar.【Method】Yellow-brown soil, fluvo-aquic soil and black soil were utilized as the tested soil. Through short-term culture experiments, 16SrRNA sequencing was used to study the effects of biochar on ammonia-oxidizing microorganisms, bacterial community structure and related enzyme gene expression in different type soils. Four treatments for each soil included CK (no fertilizer and biochar), F (single fertilization), C (single 2% peanut shell biochar), and FC (application of fertilizer + 2% peanut shell biochar).【Result】Acid soil pH increased significantly by 0.5-1.0 units after application of biochar (C, FC), but alkaline soil pH decreased significantly by 0.5-0.6 units; the microbial abundance and diversity of yellow-brown soil increased significantly caused by single application of biochar (C). The fluvo-aquic only significantly increased the microbial diversity index of the soil when it was applied to biochar alone (C). Biochar and chemical fertilizers did not significantly change soil abundance and diversity in black soil; the abundance of ammonia-oxidizing bacteria in three soils was higher than that of ammonia-oxidizing archaea. The measured OTU abundance of ammonia-oxidizing bacteria was about 8.1 times that of ammonia-oxidizing archaea. Biochar and chemical fertilizers did not significantly alter the OTU abundance in the thaumarchaeota, but had a significant effect on the OTU abundance in the beta and gamma proteobacteria. The ammonia-oxidizing bacteria of the three soils were mainly β-proteobacteria, accounting for about 60%. In addition, the application of biochar (C, FC) significantly changed the microbial community structure of yellow-brown soil on PC1 (40.4%), and significantly changed the microbial community structure of fluvo-aquic soil on both PC1 (42.3%) and PC2 (21.3%). After application of biochar (C, FC), the expression of ammonia synthesis related enzyme gene in fluvo-aquic soil decreased significantly by 14.7%-39.9% in a short period of time, and the ammoxidation archaea abundance decreased by 70.5% and 48.7% under C treatment and FC treatment, respectively.【Conclusion】After application of biochar, the microbial community structure of yellow-brown soil and fluvo-aquic soil was significantly changed, and the ammoxidation of fluvo-aquic soil was obviously inhibited in a short period of time.

biochar; chemical fertilizer; ammonia oxidation; microbial community structure; yellow-brown soil; fluvo-aquic soil; black soil

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.013

2018-09-10；

2018-10-29

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0200800）

張夢(mèng)陽，Tel：027-87287141；E-mail：zhangmengyang@webmail.hzau.edu.cn。通信作者姜存?zhèn)}，Tel：027-87287141；E-mail：jcc2000@mail. hzau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）