不同處理方法對(duì)靈芝有效成分提取率的影響

羅汝鋒，羅艷萍，藍(lán)澤基

（廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244）

0 引言

靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao） 的干燥子實(shí)體[1]。

我國(guó)是世界上最早栽培和食用靈芝的國(guó)家之一，因其具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，功效確切，早在東漢時(shí)期，我國(guó)第一部中草藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有相關(guān)收錄，并把靈芝稱為“上藥”；而之后的《本草綱目》 《開元本草》等著作中，也一直被稱為“扶正固本”“滋補(bǔ)強(qiáng)身”“延年益壽”的中藥珍寶和食療瑰寶。而我國(guó)也于2018年公開征求關(guān)于將靈芝等作為藥食同源管理意見函，這也為日后靈芝作為藥食同源產(chǎn)品的開發(fā)注入強(qiáng)大的動(dòng)力。

靈芝中含有豐富的化學(xué)成分，主要包括多糖、三萜類、蛋白質(zhì)、麥角甾醇、生物堿，以及多種微量元素等，孢子中還含甘露醇、海藻糖（Trehalose）等[2]。三萜類化合物是靈芝的主要活性成分之一，種類很多，它們是靈芝的苦味成分，其含氧功能團(tuán)對(duì)苦味的產(chǎn)生起重要作用。藥理研究表明，靈芝三萜具有解毒、保肝、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、調(diào)節(jié)免疫力等功效[3-4]。靈芝酸A和靈芝酸B是1982年首次從靈芝中分離出的三萜類化合物，具有抑制組織胺釋放、降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)肝功能等作用[5]。在日本，正是因?yàn)殪`芝酸的功效顯著，人們非常看重靈芝商品中靈芝酸的含量，并把其作為衡量靈芝及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)。靈芝多糖也是靈芝的主要活性成分，其與多種藥理活性有關(guān)，現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝多糖具有顯著的提高免疫力、抗腫瘤、清除自由基、抗衰老等活性[6-12]。因此，靈芝多糖、三萜類化合物作為主要活性成分是評(píng)價(jià)靈芝品質(zhì)高低的重要指標(biāo)。然而，不同的提取方法對(duì)于靈芝有效成分的溶出具有較大的影響，前處理方法作為提取前的重要一環(huán)同樣具有不可或缺的影響。

因此，試驗(yàn)對(duì)靈芝藥材分別進(jìn)行粗碎、粉碎、切薄片及切厚片4種處理方法后加水回流提取，測(cè)定出膏率及提取物中靈芝多糖、三萜及甾醇、靈芝酸A和靈芝酸B含量，比較不同處理方式有效成分的提取率，以篩選出有利于提取靈芝有效成分的藥材處理方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝藥材，山東省臨沂金泰藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.的干燥子實(shí)體。

靈芝酸A對(duì)照品、靈芝酸B對(duì)照品，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；D-無水葡萄糖對(duì)照品、齊墩果酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品；1260型高效液相色譜儀，安捷倫儀器有限公司產(chǎn)品；AB265-S/10型電子天平，梅特勒-托利公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 前處理

（1）粗碎處理。取靈芝藥材，除去雜質(zhì)，用破碎機(jī)（1.6 cm孔徑篩網(wǎng)）打碎。

（2）粉碎處理。取靈芝藥材，除去雜質(zhì)，用破碎機(jī)（1.6 cm孔徑篩網(wǎng)）打碎，后用高速粉碎機(jī)粉碎，使其全部通過10目。

（3）薄片處理。取靈芝藥材，揀選除雜，切成0.1~0.2 cm的薄片。

（4）厚片處理。取靈芝藥材，揀選除雜，切成0.2~0.4 cm的厚片。

1.3.2 提取工藝

前處理過的靈芝→加水回流提取3次（第1次加入10倍水，煎煮1.5 h；第2次加入8倍水，煎煮1.5 h；第3次加入5倍水，煎煮0.5 h） →過濾→濃縮→干燥→靈芝提取物。

1.4 含量測(cè)定

1.4.1 多糖含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取105℃干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對(duì)照品6 mg，精密稱定，加水溶解并定容至50 mL，制成每1 mL含0.12 mg的對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，于波長(zhǎng)625 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液的制備及含量測(cè)定：取靈芝提取物粉末約2 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過；用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置于燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置于水浴上蒸干；殘?jiān)盟? mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液；沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻；取溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置于25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計(jì)算后即得。

靈芝多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 靈芝多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.2 三萜及甾醇含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。量取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即置于冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，于波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液的制備及含量測(cè)定：取靈芝提取物粉末約 2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）45 min，濾過，濾液置于100 mL量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液0.2 mL，置15 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“揮干”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算后即得。

靈芝三萜及甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 靈芝三萜及甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.3 靈芝酸含量測(cè)定

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)；以 0.4%甲酸為流動(dòng)相 A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25℃。

靈芝酸含量測(cè)定梯度洗脫見表1。

表1 靈芝酸含量測(cè)定梯度洗脫

對(duì)照品溶液的制備：取靈芝酸A和靈芝酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.25 mg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備：取靈芝提取物粉末2.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入甲醇35 mL，超聲處理40 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取上清液用濾膜濾過，即得。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定后即得。

靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖3。

圖3 靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法對(duì)靈芝提取吸水率和出膏率的影響

不同處理方法對(duì)靈芝提取吸水率和出膏率的影響見表2。

表2 不同處理方法對(duì)靈芝提取吸水率和出膏率的影響/%

由表2數(shù)據(jù)可知，不同靈芝藥材的處理方式，對(duì)飲片吸水率有顯著性（p<0.05）的影響，直接影響著靈芝提取溶出效果，導(dǎo)致了出膏率的變化。通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，粉碎處理后的靈芝在第1次煎煮時(shí)，吸水率高達(dá)70.04%，遠(yuǎn)高于粗碎、薄片及厚片處理的吸水率（37.5%~42.47%），而切薄片和切厚片對(duì)飲片吸水率影響并不顯著（p>0.05）。同時(shí)，飲片一煎吸水率高的粉碎組，在一煎提取出膏率方面僅有1.77%，遠(yuǎn)低于其余3組處理（2.98%~4.03%）。最后，從總出膏率數(shù)據(jù)可以看出，不同的靈芝處理方式對(duì)總出膏率具有顯著性差異（p<0.05），其中，靈芝切薄片處理的總出膏率最高，達(dá)到7.30%，是粉碎處理組的1.36倍；其次為厚片組，總出膏率為6.51%。

2.2 不同處理方法對(duì)靈芝多糖提取的影響

不同處理方法對(duì)靈芝多糖提取的影響見表3。

表3 不同處理方法對(duì)靈芝多糖提取的影響/%

由表3數(shù)據(jù)可知，不同處理方式所制得的靈芝提取物多糖含量及提取率差異顯著（p<0.05）。提取物多糖含量依次為粗碎處理>厚片處理>粉碎處理>薄片處理，其中粗碎處理所制得的靈芝提取物多糖含量高達(dá)8.15%，遠(yuǎn)高于出膏率最高的薄片處理所得的靈芝提取物（6.81%），這是由于薄片組出膏率高，非多糖類物質(zhì)溶出相對(duì)較多，導(dǎo)致提取物多糖含量整體偏低。而另一方面，多糖提取率大小依次為薄片處理>厚片處理>粗碎處理>粉碎處理，說明在固定提取條件下，切薄片處理后的靈芝飲片，更利于靈芝多糖的溶出，其提取率達(dá)到了42.14%；相反的，粉碎處理后的多糖提取率僅有32.42%，粉碎后飲片吸水率高的同時(shí)，也不利于多糖的溶出。

2.3 不同處理方法對(duì)靈芝三萜及甾醇提取的影響

不同處理方法對(duì)三萜及甾醇含量的影響見表4。

表4 不同處理方法對(duì)三萜及甾醇含量的影響/%

由表4數(shù)據(jù)可知，不同處理方式所制得的提取物三萜及甾醇含量及提取率差異顯著（p<0.05）。提取物含量依次為粉碎處理>薄片處理>厚片處理>粗碎處理，粉碎處理后制得的靈芝提取物三萜及甾醇含量最高，達(dá)到1.98%，其次為薄片處理后制得的靈芝提取物，含量為1.80%；而在提取率方面，薄片處理的靈芝三萜及甾醇提取率最高，為13.85%，但4種處理方式的靈芝提取物三萜及甾醇提取率均不高，僅有6.56%~13.85%，處于較低水平，這是由于三萜及甾醇在熱水中溶解度較低所造成的。另一方面，不同處理方式對(duì)三萜及甾醇提取率的影響規(guī)律與多糖提取率的影響規(guī)律也有較大的區(qū)別，如多糖提取率最高的粗碎處理方式，其三萜及甾醇提取率僅有6.56%，這也說明，不同的靈芝處理方式對(duì)不同的有效成分溶出有較大的影響。

2.4 不同處理方法對(duì)靈芝酸（A+B）提取的影響

不同處理方法對(duì)靈芝酸（A+B）含量的影響見表5。

表5 不同處理方法對(duì)靈芝酸（A+B）含量的影響/%

靈芝酸是一種三萜類物質(zhì)，大多為四環(huán)三萜。由表5數(shù)據(jù)可知，不同處理方式所制得的提取物靈芝酸（A+B）含量及提取率差異顯著（p<0.05），其中薄片處理所制得的靈芝提取物含量最高，達(dá)到1.35%，其提取率也是最高的，達(dá)到35.2%，遠(yuǎn)高于其他處理方式的樣品。靈芝酸的提取率除了薄片處理組外，其余均不高，這是因?yàn)殪`芝酸在熱水中的溶解度較低所造成的，但整體而言，靈芝酸（A+B）的提取率比三萜及甾醇的提取率高。

3 結(jié)論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝提取過程中飲片吸水率以薄片處理為最低，這樣不僅利于靈芝多糖等水溶性成分的溶出，也利于三萜及甾醇、靈芝酸（A+B）等脂溶性成分的提取，避免有效成分過多殘留在藥渣中。結(jié)果表明，不同藥材處理方式對(duì)靈芝出膏率、多糖提取率、三萜及甾醇提取率、靈芝酸（A+B）提取率的影響差異明顯，以切薄片處理的靈芝藥材更利于有效成分的提取。

目前，關(guān)于靈芝提取工藝的相關(guān)研究較多，如劉曉艷等人[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝三萜的提取工藝，得到較高的三萜得率，白鳳岐等人[14]利用正交試驗(yàn)獲得較優(yōu)的靈芝多糖提取工藝，崔曉瑩[15]通過比較不同的提取溶劑和提取方法，獲得較理想的靈芝酸提取工藝，但研究均集中在提取溶劑、提取方法的選擇上，且大部分現(xiàn)有靈芝提取工藝文獻(xiàn)中前處理方法為破碎或粉碎處理，對(duì)靈芝藥材前處理后，對(duì)于提取的影響還沒有相關(guān)文獻(xiàn)參考，試驗(yàn)通過對(duì)藥材前處理方法的探討，為進(jìn)一步完善靈芝各項(xiàng)有效成分的溶出提供參考依據(jù)。