花生中致敏蛋白的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉勝男，孟繼秋，曹金博，李燕虹，王 耀，衛(wèi) 星

（1.三門(mén)峽出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南三門(mén)峽 472000；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南洛陽(yáng) 471023；3.三門(mén)峽市檢驗(yàn)檢疫中心，河南三門(mén)峽 472000）

花生具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含不飽和脂肪酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，可促進(jìn)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、抗老化，對(duì)胃腸功能起到保護(hù)的作用[1]。但是花生也是一種重要的致敏食物，有關(guān)學(xué)者統(tǒng)計(jì)，食品過(guò)敏的發(fā)病率很高，達(dá)到了2%，在成年人中更是高達(dá)4%~8%[2-4]。1995年，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO） 認(rèn)定的8種最常見(jiàn)的致敏食物中，花生就包括在內(nèi)。因此，為了保障消費(fèi)者的安全，大部分發(fā)達(dá)國(guó)家的食品包裝標(biāo)簽中強(qiáng)制要求標(biāo)識(shí)過(guò)敏原成分[5]。然而，當(dāng)今國(guó)際上并未給出明確統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)包裝食品中過(guò)敏原進(jìn)行標(biāo)識(shí)和限量[6-9]。而且到目前為止，針對(duì)花生過(guò)敏癥狀沒(méi)有快速有效的治療方法。因此，避免食用含有花生致敏蛋白的食物是對(duì)花生過(guò)敏人群最好的保護(hù)。為了更好地保障廣大消費(fèi)者的食品安全，對(duì)花生致敏蛋白的檢測(cè)研究和探索也就變得非常有意義。

1 花生致敏蛋白概述

花生中能引起人體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以稱(chēng)為致敏蛋白，其致敏原理就是通過(guò)有選擇性的激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白，引起I型超敏反應(yīng)。目前，已被認(rèn)可的花生致敏蛋白有13種（Ara h1到Ara h13），其中Ara h1，Ara h2和Ara h3能被大部分的過(guò)敏患者血清識(shí)別，是重要的致敏蛋白，也是檢測(cè)研究的重點(diǎn)對(duì)象。

花生過(guò)敏原的種類(lèi)及其特征見(jiàn)表1。

1.1 花生中的主要致敏蛋白

1.1.1 Ara h1

Ara h1占花生蛋白總量的12%~16%，是含量最多的致敏蛋白。其單體是分子量約為64 kD的糖蛋白[10]；Ara h1的三聚體形式?jīng)Q定了其穩(wěn)定性極高的特性，胃腸道的消化作用和加熱都不會(huì)破壞其致敏性，不容易破壞，過(guò)敏反應(yīng)非常強(qiáng)[11]。

表1 花生過(guò)敏原的種類(lèi)及其特征

1.1.2 Ara h2

Ara h2占花生蛋白總量的5.9%~9.3%[12]；Ara h2包含Ara h2.01和Ara h2.02這2種遺傳變異體[13]，分子量范圍在17~20 kD。Ara h2.02比Ara h2.01缺失了12個(gè)氨基酸[14]。由于Ara h2中二硫鍵較多，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且耐酶解。通過(guò)破壞其二硫鍵可降低其穩(wěn)定性[15-16]。Ara h2易與 Ara h1，Ara h3引起交叉反應(yīng)[17]。Ara h2可作為胰蛋白酶抑制劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮Y(jié)構(gòu)上有很高的相似度，并且加熱會(huì)使Ara h2蛋白的抑制劑活性顯著提高[18]。

1.1.3 Ara h3

Ara h3具有低聚態(tài)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[19]，屬于雙Cupin類(lèi)型[20]。Ara h3.01和Ara h3.02是其2個(gè)遺傳變異體。Ara h3存在4個(gè)與IgE結(jié)合的表位[21]。大部分花生過(guò)敏患者的血清都能識(shí)別Ara h1和Ara h2，而只有半數(shù)的亞洲患者和歐美患者的血清可以識(shí)別Ara h3，研究人員認(rèn)為Ara h3蛋白不容易被識(shí)別的原因可能是抗原表位序列被深埋在高級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，也可能與IgE抗原結(jié)合位點(diǎn)的不保守序列有關(guān)[22]。Ara h3免疫結(jié)合位點(diǎn)四級(jí)結(jié)構(gòu)比較完整，不易被蛋白酶徹底水解。Ara h3最高能耐受70~92℃的溫度，但前提是在適宜的離子強(qiáng)度下[23]。Ara h3在被水解為酸性堿性片段后，仍可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[24]。

1.2 其他致敏蛋白

Ara h1~Ara h3這3種致敏蛋白可被大部分過(guò)敏患者血清識(shí)別，相關(guān)研究相對(duì)較多。Ara h4~Ara h13只能被少數(shù)過(guò)敏患者的血清識(shí)別，相關(guān)的研究相對(duì)較少，下文主要介紹Ara h4~Ara h13目前已知的一些基本信息。

Ara h4不再被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)特的致敏蛋白，其本質(zhì)就是Ara h3.02[25]。Ara h5是一種肌動(dòng)蛋白，幾乎存在于所有真核細(xì)胞。Ara h6和Ara h7在花生中含量很低，Ara h6與Ara h2有59%的同源性，而且熱穩(wěn)定性好，耐酶解[26]；Ara h7與Ara h2有35%的同源性。Mittag D等人[27]認(rèn)為花生蛋白Ara h8是一種非常重要的致敏蛋白，它不光可以引起花生過(guò)敏，還會(huì)使樺樹(shù)花粉過(guò)敏患者過(guò)敏，但是Ara h8熱穩(wěn)定性差，不耐酶解[28]。Ara h9是一種非特異性的脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有耐酶解、耐高溫的特性[29]。Ara h10，Ara h11是從花生油脂中提取出來(lái)的，屬于油脂蛋白。Rabjohn P等人[30]首次開(kāi)發(fā)了一種新型的花生3種油脂蛋白（14，16，18 kD） 表達(dá)和純化系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的油脂蛋白與天然的油脂蛋白非常類(lèi)似。Ara h12的分子量有8，12，5.184 kD 3種，Ara h13同樣有8，11，5.472 kD 3種，都屬于防衛(wèi)素。

2 主要致敏蛋白的檢測(cè)方法

目前，檢測(cè)花生致敏蛋白的方法分為2個(gè)方面：一是基于致敏蛋白的檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫印跡（IB）、高效液相色譜技術(shù)（HPLC） 及質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）；二是基于致敏蛋白成分基因的檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）[31]。

2.1 基于致敏蛋白的檢測(cè)方法

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)被測(cè)物質(zhì)，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、時(shí)間短的特點(diǎn)。ELISA法有夾心法、間接法和競(jìng)爭(zhēng)法，其中雙抗夾心ELISA法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法適合花生致敏蛋白的檢測(cè)。閆飛等人[32]使用ELISA方法檢測(cè)了花生致敏蛋白Ara h6，IC50為414.6 ng/mL，在16.5~10 000 ng/mL的范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系，并且精確度和重復(fù)性很好。但是加熱過(guò)程會(huì)改變致敏蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，使抗體無(wú)法正確識(shí)別被檢測(cè)過(guò)敏原，產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象[33]。除此之外，ELISA這種抗原抗體的檢測(cè)模式也會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)值偏高和假陽(yáng)性現(xiàn)象，影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

2.1.2 免疫印跡

免疫印跡（Immunoblotting，IB）又稱(chēng)蛋白印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)中分析蛋白質(zhì)的常用技術(shù)，類(lèi)似于ELISA，都屬于免疫標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其原理是利用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再將分離好的蛋白質(zhì)固定在固相載體上，然后以抗體作為“探針”去檢測(cè)蛋白質(zhì)，用標(biāo)記的二抗“顯色”。

Burks[34]運(yùn)用免疫印跡的方法，通過(guò)對(duì)過(guò)敏患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，致敏蛋白為一種分子量為17 kD，等電點(diǎn)為5.2的蛋白質(zhì)。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和其氨基酸順序最終斷定此種致敏蛋白是Ara h2。目前，這種方法已經(jīng)很成熟，許多公司設(shè)計(jì)出特異性抗體用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，但是試劑盒的價(jià)格比較昂貴，可以通過(guò)回收未參與反應(yīng)的抗體并重復(fù)利用，可以在一定程度上降低檢測(cè)成本。

雖然免疫印跡的方法在檢測(cè)花生致敏蛋白試驗(yàn)中有很多優(yōu)勢(shì)，但是因?yàn)樵囼?yàn)操作的原因容易出現(xiàn)多條帶、沒(méi)有條帶、背景有黑色斑點(diǎn)、凝膠染色不均勻等現(xiàn)象，影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所以免疫印跡大多用于致敏蛋白的定性分析。

2.1.3 高效液相色譜與質(zhì)譜分析

高效液相色譜技術(shù)（High pressure liquid chromatography，HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，加入氣相色譜理論與技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。質(zhì)譜檢測(cè)花生致敏蛋白主要是根據(jù)不同致敏蛋白分子在均勻電場(chǎng)中停留時(shí)間不同，進(jìn)而達(dá)到分離鑒定的目的。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）是將復(fù)雜樣品經(jīng)過(guò)液相色譜分離后，再用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)定性的技術(shù)。將二者的分離功能和定性功能結(jié)合起來(lái)，對(duì)于復(fù)雜的混合物也可以很好地進(jìn)行定性和定量。并且樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)化了，能夠快速檢測(cè)樣品，操作也比較簡(jiǎn)單。洪宇偉等人[35]運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)花生中Ara h2致敏蛋白，其檢測(cè)限可達(dá)6.23 μg/g，回收率達(dá)到107.0%~113.2%。

此方法可對(duì)花生致敏蛋白實(shí)現(xiàn)快速定性、定量分析，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是由于對(duì)樣品和操作的要求比較高，儀器比較昂貴，使得其應(yīng)用受到限制。

2.1.4 表面等離子共振

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，是根據(jù)金屬納米粒子表面附著不同物質(zhì)導(dǎo)致折射率發(fā)生變化，其折射率的變化和待分析物質(zhì)量呈一定線(xiàn)性關(guān)系，利用此原理可實(shí)現(xiàn)對(duì)待分析物質(zhì)準(zhǔn)確的定性、定量分析。與其他檢測(cè)方法相比，SPR具有體積更小、成本更加低廉、響應(yīng)速度較快和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)[36]。Pollet J等人[37]結(jié)合SPR法與納米磁珠抗體提取技術(shù)，快速準(zhǔn)確檢測(cè)巧克力中花生過(guò)敏原Ara h1，其檢測(cè)限為0.09 μg/mL。由于SPR也采用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，所以也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性等影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的結(jié)果。

2.2 基于致敏原成分基因的檢測(cè)方法

2.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

一些花生致敏蛋白雖然由于結(jié)構(gòu)的原因，可以在高溫環(huán)境下保持活性，但是在花生實(shí)際的加工生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的加工方式，可能會(huì)使花生致敏蛋白的結(jié)構(gòu)受到破壞，免疫活性降低，此時(shí)再用抗原抗體特異性結(jié)合的傳統(tǒng)方法將會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，但普通的加工處理不能破壞花生致敏蛋白的DNA，因此可以通過(guò)PCR法來(lái)檢測(cè)花生致敏蛋白的基因。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增食品中花生源性物質(zhì)的DNA片段，通過(guò)凝膠電泳得到DNA圖譜，最后通過(guò)對(duì)比來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)展，傳統(tǒng)PCR技術(shù)已經(jīng)很成熟，近年來(lái)新研發(fā)的Real-time PCR更加方便快捷，在檢測(cè)花生致敏蛋白方面有著廣泛的應(yīng)用，且靈敏度高、特異性強(qiáng)等[38]。

Houhoula D等人[39]采集了152份樣品，采用實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明，花生樣品中有125份（83%）呈陽(yáng)性。因此，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是快速檢測(cè)和定量食品致敏蛋白的重要手段。另外，也有研究人員采用復(fù)合引物技術(shù)設(shè)計(jì)了一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)擴(kuò)增控制，建立了花生致敏蛋白Ara h1 DNA的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，其檢出限為0.005%，表明該方法對(duì)食品中花生成分的檢測(cè)具有較高的靈敏度。

目前使用PCR檢測(cè)花生過(guò)敏原由于容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的現(xiàn)象，對(duì)于PCR技術(shù)在檢測(cè)花生致敏蛋白的推廣還具有一定的局限性。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)就是在原本的PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，其中Taqman探針?lè)ê蚐YBR Green I熒光染料法是常用的熒光標(biāo)記方法。此方法通過(guò)熒光信號(hào)量的積累來(lái)實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，以達(dá)到檢測(cè)花生致敏蛋白特異性基因的目的。陳家杰等人[40]利用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)花生致敏蛋白。對(duì)8種花生食品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果8種食品中的成分均與標(biāo)簽相符，證明此方法可用于食品中花生致敏蛋白的檢測(cè)。

基于基因方面的檢測(cè)具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是，一些試驗(yàn)證明某些加工處理可除去花生中的部分致敏蛋白，但殘留的致敏基因仍能使試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，出現(xiàn)錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果，這是基因檢測(cè)手段存在的弊端。

3 結(jié)語(yǔ)

食品導(dǎo)致過(guò)敏的事件越來(lái)越多，并且復(fù)雜的加工生產(chǎn)方式使得致敏物質(zhì)更加難以檢測(cè)。因此，建立食品中花生致敏蛋白檢測(cè)技術(shù)，對(duì)保障花生過(guò)敏人群生命安全具有重要性。介紹了花生中的主要致敏蛋白和常見(jiàn)的檢測(cè)方法，但這些方法或多或少都存在一些不足之處。近年來(lái)，上轉(zhuǎn)換材料、熒光量子點(diǎn)、碳點(diǎn)等新型標(biāo)記材料的廣泛使用給花生致敏蛋白檢測(cè)方法研究提供了新的研究方向。這些新型材料與目前檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，能夠在一定程度上提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，為食品中花生過(guò)敏原的檢測(cè)提供廣闊的發(fā)展前景。