龜甲人參鹿茸片主成分組方合理性研究

翟興月，馮明明，佟長青，李 偉

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，遼寧大連 116023；2.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023）

中藥有藥食同源的說法，因此有很多的中藥既可以作為藥品，賦予其藥性功能，同時又可以作為保健食品的原料，利用其保健作用。2002年衛(wèi)生部發(fā)布的《關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中公布了可用于保健食品的人參等114種物品名單[1]，龜甲、人參和馬鹿茸都列其中。龜甲具有滋陰作用，因此具有較好的應(yīng)用前景。但由于龜甲含有的碳酸鈣為44.28%~55.85%，造成龜甲食用的不便，因此較少出現(xiàn)在保健食品中[2]。人參是重要的中藥，同時它具有保健作用，如免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞等，因此它也經(jīng)常在保健品中使用[3]。鹿茸最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中華人民共和國藥典》中記載的鹿茸是鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon Temminck，簡稱花鹿茸）或馬鹿（Cervus elaphus Linnaeus，簡稱馬鹿茸） 的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角[4]。鹿茸具有大補陽虛、壯腎陽、調(diào)精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的作用[5]。目前，市場上常見人參保健品、鹿茸保健品很多。中藥的療效特點在于多成分聯(lián)合、劑量少、多靶點、需要長時間作用[6]。在有些方面，中藥的復(fù)方優(yōu)于單方。對于中藥復(fù)方作用原理的研究，研究人員進行了大量的工作，其中以薛燕[6]提出的中藥復(fù)方作用原理的“散彈理論”為大家所認(rèn)可，這一理論后來發(fā)展為多靶點理論。趙軍寧[7]認(rèn)為中藥復(fù)方作用的特點在于“桿秤原理”和適度原理。因此，可以認(rèn)為中藥復(fù)方具有較大的臨床優(yōu)勢，以中藥材為基礎(chǔ)的復(fù)方保健食品同樣具有這一優(yōu)勢。

龜鹿二仙膏是由龜板0.5 kg，鹿角1.5 kg，枸杞子300 g，人參150 g組成[8]。由此可見，由龜甲、人參、鹿茸為主要原料組成的保健品具有理論依據(jù)及合理性。龜甲具有的滋陰作用與人參、馬鹿茸具有抗氧化、促進免疫功能的作用是一致的。因此，這3種物質(zhì)組合起來依靠多靶點聯(lián)合作用，可以充分發(fā)揮保健功效。試驗對龜甲人參鹿茸片組方主成分合理性進行了研究，以期為開發(fā)龜甲人參鹿茸片保健食品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

龜甲粉、鹿茸、人參，深圳市凱聯(lián)健康生物科技有限公司提供提供。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、補體、Hank's液、雞紅細(xì)胞，北京索萊寶科技有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)液，美國Gibco公司提供；都氏試劑，Sigma公司提供。

6~7周清潔級昆明種小鼠，體重為18~22 g，雌性，購于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心。于12 h黑暗、12 h光亮的塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，室溫23±2℃，濕度40%~60%，自由采食和飲水。

1.2 龜甲人參鹿茸片組方主成分可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量測定

不同組成的龜甲人參鹿茸片組方主成分按照質(zhì)量體積比1∶100，加dH2O，于100℃下煮沸30 min后，冷卻至室溫，補加dH2O至初始時的量，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心20 min。取上清液，測定蛋白質(zhì)含量及多糖含量。

蛋白質(zhì)含量測定采用Folin-酚法，多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。

1.3 抗體生成細(xì)胞測定

采用Jerne改良玻片法進行抗體生成細(xì)胞測定[9]。40只昆明種小鼠隨機分為4組：對照組和3個組方組（組方1為龜甲2 g，人參2 g，馬鹿茸0.5 g；組方2為龜甲2 g，人參3 g，馬鹿茸 0.5 g；組方3為龜甲3 g，人參2 g，馬鹿茸 0.5 g）。龜甲人參鹿茸粉懸溶于生理鹽水中，每天定時等體積灌胃1次，按照0.45 g/（kg·bw）的組方劑量進行灌胃，連續(xù)灌胃30 d后，每只小鼠腹腔注射2 mL 2%（V∶V）綿羊紅細(xì)胞（SRBC） 懸液進行免疫4 d。4 d后小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，于無菌Hank's液研磨，并清洗2次，用RPM1640培養(yǎng)液中制成5×106個/mL小鼠脾細(xì)胞懸液。在試管中加入與等量Hank's液混合的培養(yǎng)液0.5 mL，10%的SRBC 50，20 μL小鼠脾細(xì)胞懸液（5×106個/mL），迅速混勻后傾倒于玻璃板上的瓊脂糖薄層上，每只小鼠鋪2個玻璃板，在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，加入稀釋好的補體溶液于玻璃片架凹槽中，再孵育1.5 h后棄去補體，計空斑數(shù)[9]。

1.4 半數(shù)溶血值（HC50）測試

按1.3方法對昆明種小鼠連續(xù)灌胃各組方30 d后，每只小鼠腹腔注射2 mL 2%（V∶V）綿羊紅細(xì)

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 龜甲人參鹿茸片組方主成分可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量

研究表明，龜甲每日服用2~3 g可以起到增強免疫力的作用。衛(wèi)生部發(fā)布《批準(zhǔn)人參（人工種植）為新資源食品的公告（2012年第17號）》，批準(zhǔn)種植人參為新資源食品，限定食用量≤3 g/d。因此，設(shè)計出3種不同的組方，進行其主成分可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量測定。

各組方的蛋白質(zhì)及多糖含量見表1。胞（SRBC）懸液進行免疫4 d[10]。4 d后摘眼球取血將采集的全血于37℃下恒溫30 min，然后置于4℃冰箱中1 h，在轉(zhuǎn)速2 000 r/min下離心3 min，分離血清。用生理鹽水稀釋血清200倍。取稀釋血清1 mL置于試管內(nèi)，加入0.5 mL 10%SRBC及1 mL補體，以生理鹽水作為對照，置37℃下恒溫30 min，冰浴終止反應(yīng)。以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心3 min，取上清1 mL，加都氏試劑3 mL，于540 nm處測各管的吸光度，同時取0.25 mL 10%SRBC及4 mL都氏試劑于另一試管，混勻放置10 min后于波長540 nm處作為空白對照[10]。半數(shù)溶血值（HC50）計算如下：

表1 各組方的蛋白質(zhì)及多糖含量

由表1可知，龜甲2 g，人參3 g，馬鹿茸0.5 g的組方可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量最高，分別為1 159.8，62.0 μg/mL。根據(jù)《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，龜甲的質(zhì)量控制方法為檢測其水溶性浸出物。人參的有效成分為檢測其所含有的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re。另一方面，大量文獻報道，人參蛋白質(zhì)、多糖是人參的重要活性部位。鹿茸的蛋白質(zhì)、肽類、多糖是其重要活性部位。因此，采用測定水溶性浸出物中蛋白質(zhì)及多糖含量，可以間接反映出龜甲人參鹿茸片主要功效成分的含量。

2.2 不同組方對昆明種小鼠體液免疫功能的影響

按1.2方法對小鼠連續(xù)灌胃各組方30 d后，用Jerne改良玻片法進行抗體生成細(xì)胞測定，計算溶血空斑數(shù)。

各組方對小鼠溶血空斑數(shù)的影響見表2。

表2 各組方對小鼠溶血空斑數(shù)的影響 （，n=10）

表2 各組方對小鼠溶血空斑數(shù)的影響 （，n=10）

組 方 動物數(shù)/只 溶血空斑數(shù)/個×10-6脾細(xì)胞對照組組方1組方2組方3 10 10 10 10 204.7±41.3 254.6±51.9 319.4±44.5 283.1±46.0

由表2可知，組方2的溶血空斑數(shù)最多。溶血空斑數(shù)的多少代表著B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的能力強弱[11]。

抗體生成細(xì)胞數(shù)和半數(shù)溶血值（HC50）體現(xiàn)了體液免疫功能的強度[11]。

龜甲粉對小鼠HC50的影響見表3。

表3 龜甲粉對小鼠HC50的影響 ，n=10）

表3 龜甲粉對小鼠HC50的影響 ，n=10）

組 方 動物數(shù)/只 HC50對照組組方1組方2組方3 10 10 10 10 86.9±17.6 106.4±18.7 147.2±23.7 121.8±22.1

由表3可知，組方2的增加小鼠半數(shù)溶血值（HC50）最多。表2和表3都表明了組方2對小鼠體液免疫功能增強最多。

由上述結(jié)果可知，組方2對昆明種小鼠體液免疫功能促進作用最強，可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量最高。從組方2與組方1和組方3相比，組方2的人參含量最多，組方3的龜甲粉含量最多。因此，組方中人參的量對可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量貢獻大于龜甲的量。

3 結(jié)論

由龜甲2 g，人參3 g，馬鹿茸0.5 g構(gòu)成的組方2可溶性蛋白質(zhì)、多糖含量最高，分別為1 159.8，62.0 μg/mL。3種組方中，組方2促進小鼠B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的能力強，增加小鼠半數(shù)溶血值（HC50）最多，對小鼠體液免疫功能增強最多。因此，組方2是龜甲人參鹿茸片組方主成分的合理組成。