血小板抗體對早期流產(chǎn)和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜的預(yù)測價值

謝一唯 王瑩 李育 蔣璐茜

血小板抗體是機(jī)體對血小板表面或相關(guān)抗原產(chǎn)生免疫，導(dǎo)致血小板破壞的抗體總稱，包括人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體和人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗體兩大類，其產(chǎn)生多與妊娠、輸血或器官移植等免疫因素有關(guān)。早期流產(chǎn)是指妊娠12周內(nèi)，在無外界干預(yù)的情況下發(fā)生的流產(chǎn)。組織學(xué)明確的早期流產(chǎn)發(fā)生率約為10%～15%[1]。在婦產(chǎn)科學(xué)中，若妊娠時發(fā)生母嬰血小板血型不合的免疫，可導(dǎo)致早期流產(chǎn)和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜（neonatal alloimmune thrombocytopenia purpura，NAITP），NAITP是新生兒期較常見且嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病，在危重新生兒中的發(fā)病率占20%～40%。因胎兒繼承與母體不合的父源血小板血型抗原，有些能夠刺激母體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體，此類IgG抗體可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，致敏胎兒血小板，使之破壞，導(dǎo)致胎兒或新生兒血小板減少，進(jìn)而發(fā)生早期流產(chǎn)或NAITP，嚴(yán)重時可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、急性顱內(nèi)出血、腦水腫和內(nèi)臟出血而死亡。因此，血小板抗體篩選試驗(yàn)對于有早期流產(chǎn)史的婦女來說非常重要，可對其造成流產(chǎn)的原因作出輔助診斷，預(yù)防NAITP的發(fā)生，確保優(yōu)生優(yōu)育，現(xiàn)已受到國內(nèi)外專家的高度重視。為進(jìn)一步明確血小板抗體與早期流產(chǎn)的相關(guān)性，及血小板抗體效價水平預(yù)測NAITP的準(zhǔn)確性，筆者對175例有早期流產(chǎn)史的婦女，進(jìn)行了固相凝集法血小板抗體檢測和研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 將我院2015年3月至2018年6月收治曾有早期流產(chǎn)史的婦女175例作為觀察組，年齡20～39（29.4±3.5）歲；其中自然流產(chǎn)1次95例，2次49例，3次及以上31例。并將同期在我院生產(chǎn)的2 537例正常孕婦作為對照組，年齡 21～37（28.2±3.2）歲。兩組紅細(xì)胞不規(guī)則抗體結(jié)果均為陰性，均無輸血史，IgG抗-A、抗-B效價均＜1∶64。兩組孕婦的年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 NAITP診斷與排除標(biāo)準(zhǔn) NAITP的診斷主要依據(jù)其臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查。凡新生兒出生24h內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少癥，PLT＜150×109/L，臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜瘀點(diǎn)、瘀斑及其他部位出血，血小板減少無其他醫(yī)學(xué)原因可以解釋，即可診斷為NAITP。排除標(biāo)準(zhǔn)：輸注隨機(jī)供者血小板后即刻出現(xiàn)血小板數(shù)量升高者[2-3]。

1.3 試劑與儀器 固相凝集法血小板抗體檢測試劑盒、平板式離心機(jī)均由長春博德生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 檢測方法 采集受檢者靜脈血液標(biāo)本3ml，采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，3000r/min離心5min，留取上清液。血小板抗體檢測采用固相凝集法，嚴(yán)格按照血小板抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作和判讀結(jié)果。紅細(xì)胞平鋪在反應(yīng)孔底部或紅細(xì)胞只結(jié)合至部分孔底為結(jié)果陽性；紅細(xì)胞全部聚集在反應(yīng)孔底部中央為結(jié)果陰性。將受檢者血漿進(jìn)行1∶2～1∶256的倍比稀釋后再進(jìn)行血小板抗體的效價水平檢測，結(jié)果判讀同上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)；計算相對風(fēng)險（RR），評估血小板抗體與早期流產(chǎn)的發(fā)病關(guān)系；繪制ROC曲線，計算AUC、靈敏度、特異度及最佳截斷值，評價血小板抗體效價水平預(yù)測NAITP的準(zhǔn)確性，AUC＞0.9為準(zhǔn)確性較高，0.7～0.9為有一定的準(zhǔn)確性，0.5～0.7為準(zhǔn)確性較低，＜0.5為無價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血小板抗體檢測結(jié)果的比較 觀察組175例中血小板抗體陽性者為34例（19.43%），對照組2537例中血小板抗體陽性者為74例（2.92%），觀察組血小板抗體陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 觀察組不同流產(chǎn)次數(shù)患者血小板抗體與陽性率的分布 觀察組175例早期流產(chǎn)婦女的血小板抗體，按流產(chǎn)次數(shù)分為3組，其中流產(chǎn)1次95例，血小板抗體陽性12例（12.63%），流產(chǎn) 2次 49例，陽性10例（20.41%），流產(chǎn)3次及以上31例，陽性12例（38.71%）。隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，血小板抗體陽性率逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.20，P＜0.05）。

2.3 血小板抗體與早期流產(chǎn)的關(guān)系 兩組血小板抗體陽性的108例中有早期流產(chǎn)史34例，無早期流產(chǎn)史74例，患病率31.48%；血小板抗體陰性的2 604例中有早期流產(chǎn)史141例，無早期流產(chǎn)史2 463例，患病率5.41%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=116.73，P＜0.01），RR=5.82，說明血小板抗體陽性者發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險為血小板抗體陰性者的5.82倍，血小板抗體陽性者患病率顯著增高。

2.4 血小板抗體效價水平對NAITP發(fā)病的預(yù)測價值血小板抗體效價用于預(yù)測NAITP時，AUC為0.802，最佳截斷點(diǎn)為1∶32，診斷準(zhǔn)確度中等，表明效價水平在1∶32時具有良好的預(yù)測價值，該截斷點(diǎn)用于診斷時靈敏度 0.714，特異度 0.854，P=0.008，95%CI：0.614～0.990；提示如果效價≥1∶32，新生兒發(fā)生NAITP的可能性較大，其水平在一定程度上可預(yù)測NAITP的發(fā)生（圖1）。

圖1 NAITP患者血小板抗體效價預(yù)測的ROC曲線

3 討論

血小板血型抗原主要有兩大類，即血小板相關(guān)抗原和血小板特異性抗原。血小板表面存在的與其它細(xì)胞或組織共有的抗原，稱為血小板相關(guān)抗原，包括組織相容性抗原和紅細(xì)胞血型系統(tǒng)相關(guān)抗原，如ABO血型抗原；由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，并且不存在于其它細(xì)胞和組織上的抗原稱為血小板特異性抗原[4]。血小板抗體是由血小板特異性抗原或HLA抗原通過輸血、妊娠等免疫刺激而產(chǎn)生。

現(xiàn)代臨床研究顯示，血小板抗體是造成同種免疫性血小板減少癥的直接原因。血小板輸注無效（PTR）、輸血后紫癜（PTP）、NAITP等疾病均與人類血小板同種抗原導(dǎo)致的血小板同種免疫有關(guān)，而HPA的免疫與不同人群中HPA抗原的分布頻率有關(guān)，若HPA系統(tǒng)中不配合的對偶抗原比例越高，則產(chǎn)生抗體的概率就越高[5]。Raghupathy等[6]將正常經(jīng)產(chǎn)婦與有不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)史的婦女對胎盤抗原反應(yīng)性進(jìn)行比較，證明正常妊娠時胚胎中與母親不合的父源性抗原可刺激母體免疫系統(tǒng)發(fā)生Th2反應(yīng)，從而產(chǎn)生HLA抗體、血小板抗體、紅細(xì)胞抗體和各種細(xì)胞因子抗體等。由于不同個體間免疫反應(yīng)存在差異，因此不同孕婦妊娠時會產(chǎn)生不同的抗體，且隨著妊娠次數(shù)的增加產(chǎn)生某種抗體的概率也相應(yīng)增加。

本研究結(jié)果表明，有早期流產(chǎn)史者血小板抗體陽性率顯著高于正常孕婦，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且血小板抗體陽性者發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險較血小板抗體陰性者高。隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，血小板抗體陽性率逐步增高，兩者呈正比關(guān)系。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期婦女免疫功能發(fā)生相應(yīng)變化，體液免疫功能增強(qiáng)，細(xì)胞免疫被抑制，這種變化有利于胚胎保護(hù)。然而，母體免疫功能紊亂對妊娠造成不利影響。母嬰間血型不合引起的同種免疫是孕婦不明原因流產(chǎn)的主要因素[7]。流產(chǎn)可發(fā)生在早期（孕4個月左右）也可發(fā)生在晚期（孕8個月左右）。母嬰間紅細(xì)胞血型抗體不合是導(dǎo)致晚期習(xí)慣性流產(chǎn)的主要原因，而因血小板在妊娠早期比紅細(xì)胞更容易進(jìn)入母體血液循環(huán)中，母嬰間血小板血型不合的血小板抗體（包括HPA抗體和HLA抗體）是導(dǎo)致早期流產(chǎn)及NAITP的主要原因。反復(fù)多次妊娠可使HPA和HLA-I類抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，妊娠次數(shù)與同種免疫有密切關(guān)系，這些抗體主要是由先前的妊娠免疫刺激母體所產(chǎn)生。lgG抗體由于分子量小，在妊娠早期（約14周）就能通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，使胎兒血小板破壞，導(dǎo)致孕婦早期流產(chǎn)或NAITP[8-10]。在新生兒期，NAITP是第二常見的溶血性疾病，位居貧血之后，這是一種病死率較高的新生兒血小板減少癥，患病胎兒和新生兒可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)臟出血、腦水腫，嬰兒出生時伴隨廣泛的瘀點(diǎn)和瘀斑，或2～3d后出現(xiàn)血小板減少癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示血小板顯著減少。

RAhya等[11]報道，NAITP主要與HPA多態(tài)性有關(guān)，在高加索人中，90%的NAITP是由HPA-la抗體引起，而且高于1∶32的抗體滴度與嚴(yán)重的血小板減少相關(guān)。目前NAITP主要是通過鑒定血小板抗原和檢測血小板抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。但在國內(nèi)，對于該病的研究資料不夠豐富，臨床重視程度也不夠，孕婦產(chǎn)前檢查時很少有針對性地進(jìn)行血小板血型相關(guān)的檢測，報道的NAITP多數(shù)是出現(xiàn)嚴(yán)重后果時才通過新生兒免疫血液學(xué)檢測而明確診斷。由于該病的病死率較高（達(dá)13%），因此，早期檢查、早期診斷并干預(yù)治療非常重要，可減少圍生兒的發(fā)病率及死亡率。應(yīng)注意血小板抗體的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗體效價高的可及早進(jìn)行藥物治療或血漿置換治療。本研究的ROC曲線結(jié)果顯示，AUC為0.802，通常來說，當(dāng)AUC在0.8～0.9時，可認(rèn)為該指標(biāo)具有較好的預(yù)測價值及準(zhǔn)確性。因此，上述研究結(jié)果提示利用血小板抗體效價預(yù)測NAITP時，若效價≥1：32，則新生兒發(fā)生NAITP的可能性較大，其水平可在一定程度上預(yù)測NAITP的發(fā)生。對于NAITP風(fēng)險較高的孕婦，可通過靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）或聯(lián)合使用IVIG與糖皮質(zhì)激素進(jìn)行產(chǎn)前治療，以減少NAITP和顱內(nèi)出血的風(fēng)險[6]。但因目前的研究數(shù)量較少，需進(jìn)一步加大樣本量及進(jìn)行多中心研究來確定其臨床應(yīng)用價值，如果增加樣本數(shù)量，仍獲得較好的臨床預(yù)測效果，血小板抗體結(jié)果有望作為非侵入性預(yù)測NAITP的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床進(jìn)行早期干預(yù)和治療[12]。

目前國內(nèi)外臨床上檢測血小板抗體的方法主要有功能性試驗(yàn)、酶標(biāo)法、熒光法及固相凝集法4類方法[13-14]，但大多數(shù)方法試劑昂貴，操作步驟復(fù)雜，因而實(shí)驗(yàn)室檢測受到局限。傳統(tǒng)方法采用甲醛固定血小板，導(dǎo)致其抗原結(jié)構(gòu)破壞，有可能漏檢某些抗體，而固相凝集法將抗人血小板單克隆抗體與完整血小板結(jié)合，并使其固定在反應(yīng)孔底部，避免了出現(xiàn)漏檢的可能。該方法能同時檢測HLA抗體和HPA抗體，操作簡便，無需特殊儀器，且1h內(nèi)可完成檢測。其穩(wěn)定性、靈敏度與特異性均較好，不僅可手工小量操作，也可上機(jī)進(jìn)行大規(guī)模檢測，能滿足各級醫(yī)療單位的臨床應(yīng)用。

血小板抗體陽性者，患者發(fā)生流產(chǎn)、死胎、不孕不育、NAITP等相應(yīng)疾病的風(fēng)險較大。建議臨床采取干預(yù)和治療措施，如IVIG、糖皮質(zhì)激素等；可疑陽性者，要對患者給予風(fēng)險提示，告知下次妊娠可能會導(dǎo)致血小板抗體強(qiáng)度增強(qiáng)，從而引起相關(guān)疾病?？山ㄗh患者以中醫(yī)調(diào)理為主；血小板抗體陰性，基本可排除由血小板抗體引起相關(guān)疾病的可能。

綜上所述，血小板抗體篩選對有反復(fù)多次早期流產(chǎn)史婦女尤為重要，它可作為預(yù)測高危妊娠是否流產(chǎn)的一種較為敏感的指標(biāo)，是無創(chuàng)性評估的較好方法，為流產(chǎn)的早期診斷治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，可提前預(yù)判孕婦發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險。它能有效地探討早期流產(chǎn)的病因、早期預(yù)測及預(yù)防NAITP的發(fā)生，能更好地服務(wù)于臨床，指導(dǎo)臨床醫(yī)生做好孕前干預(yù)、孕期篩查治療和風(fēng)險評價工作，必要時可對孕婦進(jìn)行IVIG、糖皮質(zhì)激素等治療，從而提高優(yōu)生優(yōu)育的水平。而且，隨著分子生物學(xué)檢測的發(fā)展，筆者相信，其也能預(yù)測免疫性胎兒或新生兒疾病的發(fā)生與否，與血清學(xué)結(jié)果進(jìn)行相互印證，為臨床防治提供相應(yīng)的佐證條件。關(guān)于此方面的進(jìn)展尚有進(jìn)一步研究價值，其臨床應(yīng)用價值還需擴(kuò)大驗(yàn)證。