耐多藥結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮藥物的耐藥特性及分子機(jī)制的研究

石慶新 楊陽 蔡鶯鶯 周鐵麗

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球大約有1/3人口潛伏感染，其中5%～10%發(fā)展為結(jié)核病患者[1]。近年來，由于流動人口的增加、不規(guī)范治療、患者依從性低等原因?qū)е履投嗨幏谓Y(jié)核發(fā)生，也是結(jié)核病疫情上升的主要原因[2]。因此，預(yù)防和治療耐多藥肺結(jié)核成為結(jié)核病防治的關(guān)鍵。喹諾酮類藥物作為抗肺結(jié)核的二線藥物[3]，在耐多藥肺結(jié)核患者和（或）不能耐受一線抗結(jié)核藥物的肺結(jié)核患者治療中起非常重要作用。該類抗菌藥物具有抗菌譜廣、口服吸收好、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種感染性疾病治療。由于喹諾酮藥物濫用，結(jié)核分枝桿菌對該藥物敏感性呈逐年下降趨勢，影響結(jié)核病患者的療效。本課題通過開展耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDRTB）對喹諾酮類藥物體外藥敏實(shí)驗(yàn)和喹諾酮類藥物耐藥基因突變位點(diǎn)的檢測研究，了解MDRTB對喹諾酮類藥物耐藥特點(diǎn)及分子機(jī)制，為探索新一代氟喹諾酮類藥物如莫西沙星、加替沙星等治療MDRTB提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2016年1月至2018年3月臺州各縣市區(qū)臨床分離80株非重復(fù)MDRTB[溫嶺市第一人民醫(yī)院16株、臨海市第一人民醫(yī)院10株、臺州市第一人民醫(yī)院11株、臺州市立醫(yī)院8株、臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院8株、玉環(huán)市第一人民醫(yī)院9株、天臺縣人民醫(yī)院5株、三門縣人民醫(yī)院7株、仙居縣人民醫(yī)院6株]。納入標(biāo)準(zhǔn)：從臺州各縣市區(qū)診斷肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中分離出利福平和異煙肼同時耐藥的結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)對氧氟沙星的敏感性分為兩組：氧氟沙星耐藥結(jié)核分枝桿菌（RMDRTB）組40株和氧氟沙星敏感結(jié)核分枝桿菌（SMDRTB）組40株。

1.2 試劑與儀器 氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星（中國上海源葉生物技術(shù)有限公司）；細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、Extractor 36DNA提取儀（中國成都博奧生物有限公司）；Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR（美國 Bio-Rad公司）；細(xì)菌分散儀（中國廣東體必康生物科技有限公司）；質(zhì)控菌株結(jié)核分枝桿菌H37Rv（ATCC27924）（中國藥品生物制品檢定所）。

1.3 微量孔Alamar Blue顯色法檢測最小抑菌濃度（MIC） 參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，在無菌分離管中加入0.9%氯化鈉溶液1.5ml，加入3～4周鮮培養(yǎng)物，把無菌分離管插入細(xì)菌分散儀分散，配成1.0MCF的菌懸液，約為3×107CFU/ml濃度菌液。用7H9肉湯將配制好的菌懸液稀釋25倍。在96孔微量無菌平板中，從A～H列的1～12孔中加入7H9肉湯溶液100μl，先分別把氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星粉劑配制成1 000 μg/ml藥物原液，然后稀釋到32μg/ml藥液，再把濃度為 32μg/ml藥液100μl加入第1孔，混勻后取出100μl，加入第2孔，同樣連續(xù)2倍稀釋至第10孔，第11孔為無藥物陽性對照孔，第12孔為無菌陰性對照孔。從A～H列的1～11孔加入菌懸液100μl。用封板膜密封，放入37℃孵育箱，第6天加入30μl無菌0.1g/L刃天青溶液，37℃孵育24h。如果第11孔呈粉紅色，則在其他各孔中加顯色液，37℃孵育24h，記錄觀察結(jié)果；如果第11孔為藍(lán)色，在第9和11天繼續(xù)觀察。藍(lán)色不變色孔的藥物濃度為菌株的MIC值。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]，氧氟沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星對結(jié)核分枝桿菌的MIC 判 斷 折 點(diǎn) 分 別 為 2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml 和0.5μg/ml，4種藥物對結(jié)核分枝桿菌MIC值分別大于各自MIC判斷折點(diǎn)為耐藥，4種藥物對結(jié)核分枝桿菌MIC值分別小于等于各自MIC判斷折點(diǎn)為敏感。

1.4 引物設(shè)計 參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計引物，gyrA基因上游引物為 5′-CCGGATCGAACCGGTTGACAT-3′，下游引物5′-GGGCTTCGGTGTACCTCAT-3′，擴(kuò)增gyrA基因耐藥決定區(qū)片段長度為358bp；gyrB基因上游引物為5′-AACACCGAGGTCAAATGGTT-3′，5′-CTGAATGCCGTCTTC CTTGTTGT-3′，擴(kuò)增gyrB基因耐藥決定區(qū)片段長度為695bp。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

1.5 核酸提取 先加入80μl DNA提取液于提取管，加入20μl上述的菌懸液，放入Extractor36 DNA提取儀，振蕩 10min，95℃金屬浴 15min，12 000 r/min離心1min。

1.6 基因擴(kuò)增 PCR的反應(yīng)體系為30μl：包括rTaq 0.15μl，dNTP 0.5μl，PCR buffer 2.5μl，引物 2μl，模板 1μl，雙蒸水23.85μl。放入Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的條件：預(yù)變性94℃5min；變性95℃ 30s、退火55℃ 30s、延伸72℃ 2min進(jìn)行35個循環(huán)；終延伸72℃10min。

1.7 序列測定 PCR產(chǎn)物送上海鉑尚生物科技有限公司測序。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Whonet5.6統(tǒng)計軟件分析結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性和MIC50數(shù)據(jù)；采用Alignment軟件對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 喹諾酮類藥物對結(jié)核分枝桿菌的MIC SMDRTB組結(jié)核分枝桿菌對氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的敏感率均為100%。RMDRTB組結(jié)核分枝桿菌對氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感性分別為0%、30.0%、42.5%和40.0%。氧氟沙星低濃度（MIC≤4μg/ml）耐藥RMDRTB組結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感率分別為46.7%、80.0%和73.3%。兩組結(jié)核分枝桿菌對4種喹諾酮類藥物的敏感率和MIC分布見表1。

2.2 耐多藥結(jié)核分枝桿菌gyr基因的序列分析MDRTB通過測序與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv序列進(jìn)行比對，在RMDRTB組中發(fā)現(xiàn)有33株gyrA基因發(fā)生突變，突變率為 82.5%，gyrA基因 Ala90Val突變 7株，Ser91Pro突變8株，Asp94Gly突變 12株，Asp94His突變 2株，Asp94Asn突變2株，Asp94Ala突變2株；發(fā)現(xiàn)有2株gyrB基因發(fā)生突變，突變率為5%，這2株gyrB基因株均與gyrA基因同時發(fā)生突變，突變類型為Thr478Asn+Asp94Gly和Asn477Thr+Asp94Gly；在SMDRTB組未發(fā)現(xiàn)gyr基因發(fā)生突變。gyrA基因部分位點(diǎn)的突變測序結(jié)果圖見圖1。氧氟沙星與左旋氧氟沙星耐藥菌株檢測到Ala90Val、Asp94Ala、Asp94His等 7 種gyr基因突變類型；莫西沙星和加替沙星耐藥菌株檢測到5種gyr基因突變類型。

表1 80株MDRTB對喹諾酮類藥物的MIC

圖1 結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控菌株H37Rv與臨床菌株的gyrA基因的測序比對[a：質(zhì)控菌株（H37Rv）部分gyrA基因測序圖；b：臨床菌株gyrA基因Ala90Val（GCG→GTG）突變測序圖；c：臨床菌株gyrA基因 Ser91Pro（TCG→GTG）突變測序圖；d：臨床菌株gyrA基因Asp94Gly（GAC→GGC）突變測序圖]

2.3 40株RMDRTBgyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布gyrA基因Ala90Val、Asp94Ala及Asp94His突變菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 4～8μg/ml，MIC50為 4μg/ml。gyrA基因Ser91Pro突變菌株氧氟沙星的MIC范圍4～16μg/ml，MIC50為 8μg/ml。gyrA基因 Asp94Asn 突變菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 8～16μg/ml，MIC50為 8μg/ml。gyrB基因與gyrA基因同時發(fā)生突變2株菌氧氟沙星的 MIC 為 16μg/ml，MIC50為 16μg/ml。未發(fā)生突變的RMDRTB 菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 4～16μg/ml，MIC50為4μg/ml。40株RMDRTBgyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布見表2。

3 討論

近年來，在治療結(jié)核分枝桿菌感染過程中出現(xiàn)了對三代氟喹諾酮藥物類耐藥的現(xiàn)象。據(jù)報道，各地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮類藥物存在不同程度的耐藥[8]。本研究通過檢測喹諾酮類藥物對MDRTB的MIC值，發(fā)現(xiàn)氧氟沙星低濃度耐藥的MDRTB對莫西沙星和加替沙星敏感性高于左氧氟沙星，與國內(nèi)外報道一致[9-10]。提示氧氟沙星與左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星存在一定程度的交叉耐藥。莫西沙星和加替沙星所顯示出更好抗菌活性是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中甲氧基取代C-8位上的氫原子，莫西沙星還具有較低的防突變濃度[11]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，莫西沙星和加替沙星與一線藥物聯(lián)合使用在治療復(fù)發(fā)和耐多藥的結(jié)核患者具有良好的效果[12]。體內(nèi)外的研究表明莫西沙星對氧氟沙星低濃度耐藥MDRTB和SMDRTB有很好的殺菌作用，莫西沙星可以作為治療氧氟沙星低水平耐藥的耐多藥肺結(jié)核患者推薦藥物。

氟喹諾酮類抗菌藥物作用于結(jié)核分枝桿菌的靶位是DNA旋轉(zhuǎn)酶（Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶），主要是通過阻止DNA的復(fù)制導(dǎo)致死亡。DNA旋轉(zhuǎn)酶是由gyrA基因編碼的兩個A亞基和gyrB基因編碼的兩個B亞基組成的四聚體。結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的主要分子機(jī)制是gyr基因中喹諾酮耐藥決定區(qū)發(fā)生突變。本研究檢到gyrA基因突變率為82.5%，與文獻(xiàn)報道接近[13]。結(jié)核分枝桿菌gyrA耐藥決定區(qū)突變類型存在于88-94位密碼子，其中最常見是94位密碼子Asp，Asp可被Gly、Asn、Ala、His和 Tyr等 5種氨基酸替換[8]。在本實(shí)驗(yàn)中檢測到gyrA94位密碼子Asp被前面4種氨基酸取代突變類型。實(shí)驗(yàn)中還檢到2株RMDRTB發(fā)生gyrB基因突變，gyrB的基因突變比gryA基因突變發(fā)生率低得多，與國內(nèi)外的文獻(xiàn)報道一致[5，9，12]。相關(guān)研究表明gyrB突變使氟喹諾酮耐藥表型的檢出率提高了12%[14]。雖然結(jié)核分枝桿菌gyrB基因的突變率很低，但與喹諾酮類藥物耐藥也密切相關(guān)，也不能忽略。

表2 40株RMDRTB gyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布

本研究數(shù)據(jù)表明：RMDRTB的gyrA基因Ser91Pro和Asp94Asn位密碼子的突變與喹諾酮類藥物高水平耐藥相關(guān)；gyrA基因 Ala90Val、Asp94His和 Asp94Ala位密碼子的突變與喹諾酮類藥物低水平耐藥相關(guān)，與文獻(xiàn)報道一致[15]。RMDRTB在gyrA和gyrB基因同時發(fā)生突變比gyrA基因單獨(dú)突變時的氧氟沙星抑菌濃度上升2～4倍，提示兩個基因同時突變可能與喹諾酮類藥物高水平耐藥相關(guān)，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[10]。gyr不同突變位點(diǎn)與耐藥水平相關(guān)，可能是由于基因位點(diǎn)突變后轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響喹諾酮類藥物與DNA解旋酶結(jié)合的穩(wěn)定程度，影響耐藥水平。在分子檢測過程中考慮gyr基因突變組合可以提高預(yù)測氟喹諾酮耐藥表型的準(zhǔn)確性。本研究有7株RMDRTB的gyrA和gyrB基因耐藥決定區(qū)未檢測到突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)可能發(fā)生在篩選的耐藥決定區(qū)域之外的突變的gyr基因和在其它基因上，如MFPA（Rv3361c），或主動外排泵RV2686c-Rv2687c-Rv2688c操縱子，與喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)[13]。其MIC50為4μg/ml，可能與喹諾酮類藥物低水平耐藥相關(guān)，由于檢測數(shù)量少和突變位點(diǎn)未檢測，需要增加標(biāo)本數(shù)量和進(jìn)一步研究確定其他相關(guān)的分子耐藥機(jī)制。

綜上所述，莫西沙星在體外對氧氟沙星低濃度耐藥MDRTB和SMDRTB活性高于氧氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星喹諾酮藥物，gyr基因突變對莫西沙星敏感性的影響小于左旋氧氟沙星和加替沙星，莫西沙星可以作為臨床治療氧氟沙星低水平耐藥的MDRTB患者首選藥物。