斑貼試驗在化妝品行業(yè)的應用

王 曉，畢永賢，錢舒敏，劉紅艷，葉 迎，蔣麗剛

（珀萊雅化妝品股份有限公司，浙江 杭州 310012）

斑貼試驗對《化妝品皮膚病診斷標準及處理原則》（GB17149.1-17149.7-1997）中定義的6種化妝品不良反應的評價作用如下：化妝品接觸性皮炎：占化妝品皮膚病的70%～90%，包括刺激性接觸性皮炎和變應性接觸性皮炎，多種改進的斑貼方法主要圍繞其進行試驗研究，并具有區(qū)分和確診價值；化妝品痤瘡：通過斑貼進行的致粉刺試驗，對化妝品產(chǎn)品是否會引起潛在的黑頭、粉刺、痤瘡等癥狀有著重要的評估意義；化妝品毛發(fā)損害：一般而言，斑貼試驗對化妝品毛發(fā)損害的臨床診斷意義不大；化妝品甲損害：單獨甲板損害無需進行斑貼試驗，若有甲周皮膚損害，斑貼試驗具有臨床診斷意義；化妝品光感性皮炎：特殊的光斑貼試驗，針對化妝品誘發(fā)的光變應性、光毒性等皮膚癥狀；化妝品皮膚色素異常：對于炎癥后色素沉著，斑貼試驗結(jié)果對最終的臨床診斷有一定參考作用。由此可見，斑貼試驗不僅是診斷化妝品接觸性皮炎的金標準[1]，還對其他化妝品不良反應的評估及診斷起到重要作用[2]。

1 斑貼試驗的分類

根據(jù)來源對化妝品斑貼試驗進行分類。從方法學來講，針對每種斑貼方法的應用性，又進行了評估性或診斷性歸類。評估性斑貼試驗，多用于產(chǎn)品安全性評價，受試對象為健康志愿者，受試物多為化妝品終產(chǎn)物等待檢樣品，需嚴格控制受試物劑量，受試時間依規(guī)范要求通常為24 h，一般在去除受試物后0.5 h、24 h、48 h觀察皮膚反應，報告中不區(qū)分刺激性或變應性反應，評估結(jié)論以群體為基礎(chǔ)；診斷性斑貼試驗，多用于化妝品皮膚病的診斷或?qū)ふ姨囟ㄟ^敏原，受試對象多為皮膚病患者，受試物以標準系列變應原（多為歐洲標準變應原系列中的26個檢測抗原）[3]或自制變應原（可以是單一物質(zhì)、混合物或具有代表性的成分結(jié)構(gòu)）為主[4,5]，劑量限定相對不嚴格，常規(guī)的最基本的致敏性斑貼試驗受試時間為48 h，一般在去除變應原后0.5 h、72 h、96 h和7 d后觀察皮膚反應，結(jié)果判讀需區(qū)分是刺激性反應或變應性反應，診斷結(jié)論針對受試者個體。

1.1 規(guī)范內(nèi)的斑貼試驗

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范2015版》中規(guī)定的人體斑貼試驗包括：①皮膚（單次）封閉型斑貼試驗；②皮膚重復性開放型涂抹試驗，詳細的試驗流程及適用范圍，請參考規(guī)范內(nèi)容，文章不做贅述，以上2種方法均屬于評估性斑貼試驗。

規(guī)范描述到“斑貼試驗適用于檢測化妝品產(chǎn)品對人體皮膚潛在的不良反應”，而未提及這“不良反應”往往有兩種情況：刺激性反應或過敏性反應。前者不涉及免疫應答過程（即致敏過程），刺激反應的程度主要與刺激物濃度及接觸皮膚時間有關(guān)，只要刺激性超出皮膚耐受的閾值，任何使用者都會發(fā)生陽性反應。后者則屬于一種遲發(fā)性免疫應答過程，需誘導才能在少數(shù)敏感性個體上形成致敏狀態(tài)。

實際上，單從一次基礎(chǔ)的斑貼試驗的陽性結(jié)果很難準確地判斷出是刺激性反應還是過敏性反應，尤其在陽性反應很微弱的情況下，而對兩者的區(qū)分，對指導消費者合理使用化妝品、正確看待化妝品引起的不良反應有重要意義。那么下面諸多研究中改進的各類斑貼方法，將呈現(xiàn)出獨特的針對性了。

1.2 其他各類斑貼試驗

人體皮膚多次累積刺激性斑貼試驗：屬評估性斑貼試驗，用于檢測化妝品中的微量可疑成分及重復接觸某些產(chǎn)品的潛在刺激性。類似的有累積刺激試驗、重復刺激試驗、最大化刺激試驗。例如，畢志剛等[6]對市售六種維A酸外用制劑進行了皮膚累積刺激性評估，對受試者進行每周4次24 h和1次72 h的斑貼試驗，共觀察3周，對15次斑貼試驗的局部皮膚反應等級進行評分，再計算平均累積刺激指數(shù)（MCII）；以累積方式激發(fā)出原本刺激性很微弱且難以進行刺激性比較的常用維A酸制劑的潛在刺激性，另外還得出，產(chǎn)品的刺激作用可能由藥物本身、藥物濃度或基質(zhì)引起。

48 h人體皮膚封閉/半封閉斑貼試驗：屬經(jīng)典診斷性斑貼試驗，主要用于尋找變應原。香精、防腐劑、色素，是化妝品中常見致敏成分；植物來源活性物、防曬霜中的紫外吸收劑、眼霜中的收斂劑、美白產(chǎn)品中的美白成分等，都可能是引起化妝品過敏的變應原[7]。化妝品過敏原人體皮膚48 h斑貼試驗的臨床研究，可為化妝品研發(fā)機構(gòu)篩選原料或配方、為消費者有效避免化妝品類過敏原提供幫助[8,9]。

致敏試驗（Human Repeated Insult Patch Test），也稱人體重復激發(fā)斑貼試驗或人重復性損傷性斑貼試驗：常歸于診斷性斑貼試驗，通過變應原多次誘導后再激發(fā)，預測或鑒定潛在的過敏原。北京大學第一醫(yī)院皮膚科對11種化妝品進行了人重復性損傷性斑貼試驗，過程如下：誘導期，在背部同一位置重復9次斑貼試驗，休息2周后，在非斑貼部位進行激發(fā)試驗，HRIPT結(jié)果以誘導期和激發(fā)期皮膚綜合反應判定。仲少敏等[10]認為出于倫理方面的考慮，HRIPT并不適合預測或鑒定潛在的致敏原，其敏感性高，可明確區(qū)分刺激性、已致敏性和潛在致敏性，主要作為確證試驗。其陰性結(jié)果，被認為是證明產(chǎn)品不會在人體產(chǎn)生不良反應的最可信方法。目前國內(nèi)很少有人采用HRIPT進行化妝品安全性評估工作。

致粉刺試驗：屬評估性斑貼試驗，在背部同一部位實施48 h封閉斑貼，3次/周×4周，取涂抹部位硅膠倒模，顯微鏡觀察微粉刺數(shù)量，評估產(chǎn)品是否有引起痤瘡或黑頭粉刺的潛在風險?；瘖y品及醫(yī)藥部外用品等貼有“已通過致敏性試驗”、“已通過致粉刺試驗”標識的商品，需進行致敏試驗、致粉刺試驗。

人體皮膚損傷模型斑貼試驗：屬評估性斑貼試驗，例如皮膚劃痕試驗，是一種利用受損皮膚模型評估化妝品刺激性的方法；又如肥皂小室試驗，是專門用來評估肥皂產(chǎn)品是否會引起皮膚干裂或剝落的一種方法；另外，還可建立其他合理的損傷模型，如有些活性成分，因分子量大而較難透過皮膚角質(zhì)層，可考慮使用膠帶重復粘貼或DMSO加強皮膚滲透，在此應考慮DMSO的刺激性，提示將DMSO與水以一定比例混合后使用[11]。

光皮膚斑貼試驗：對于檢測化妝品的光毒性而言，其屬于評估性斑貼試驗；用于光變應性皮炎的研究或?qū)ふ夜庾儜?，則屬于診斷性斑貼試驗[12]。通過在皮膚表面敷貼化妝品或光變應原，并同時接受一定劑量某波段紫外線（通常為UVA段，也有研究采用UVA+UVB段），檢測光毒性或光變應性皮炎。光毒性斑貼試驗，用來評價對皮膚局部使用化妝品并暴露于光下是否會有不良反應發(fā)生，光毒性反應與劑量有關(guān)，反應局限于照射區(qū)，并呈現(xiàn)出日曬特征。光斑貼試驗結(jié)果判讀見表1。

表1 光斑貼試驗結(jié)果判讀分類Tab.1 Interpretation and classification of photo-patch test results

目前國內(nèi)主要參照光照性皮膚病研究組（EMCPPTS）制定光斑貼試驗基礎(chǔ)變應原，含19種紫外吸收劑；引起光變應性皮炎的變應原大致有：遮光劑（如羥苯甲酮）、抗生素、芳香劑等[13]。

SLS斑貼試驗：評估受試者是否容易產(chǎn)生刺激性皮炎，這是一種皮膚屏障功能評價手段[14]，反映受試者皮膚的易感性。往往在診斷性斑貼試驗中，加入一個SLS樣品點，由于SLS易透過角質(zhì)層引起刺激反應，若SLS點為陽性，說明其他抗原所引起的非特異性紅斑極可能是刺激反應，若SLS點為陰性，說明紅斑反應是變態(tài)反應。

2 斑貼試驗應用范疇

2.1 化妝品安全性/適應性評估

不少有能力的企業(yè)會在公司內(nèi)部進行斑貼試驗，主要是人體皮膚單次封閉型斑貼試驗，作為化妝品安全與風險管理的重要一環(huán)。試驗首先應滿足國家相關(guān)規(guī)定和倫理學要求，另外需由2～3名皮膚科專業(yè)醫(yī)師按照統(tǒng)一標準進行結(jié)果判讀[15]。對于一些規(guī)模較小的化妝品企業(yè)，可與第三方檢測機構(gòu)合作，對原料的把控、配方的篩選及優(yōu)化進行有效評價。另外，可根據(jù)產(chǎn)品的特性或?qū)Ξa(chǎn)品的關(guān)注程度設計重復性刺激試驗、最大化刺激試驗等[1]。目前我國有7家化妝品行政許可人體安全性檢驗機構(gòu)，負責特殊類化妝品上市前的人體安全性評測。

2.2 化妝品皮膚病的診斷

雖然國家頻繁出臺化妝品相關(guān)法規(guī)，對產(chǎn)品上市前的監(jiān)管也日趨完善，但隨著化妝品的廣泛使用、創(chuàng)新產(chǎn)品及原料種類的多樣化，化妝品不良反應的報道不斷增加，化妝品皮膚病也日益增多，其中絕大部分屬于化妝品接觸性皮炎。

斑貼試驗是診斷化妝品接觸性皮炎的可靠方法：通過對標準抗原或自制抗原進行斑貼試驗，可以幫助受試者找出致敏物質(zhì)，確定其與臨床的關(guān)系；通過化妝品終產(chǎn)物斑貼試驗，可以幫助受試者確認致敏化妝品，避免引起更大的損失和傷害[2,16]。研究化妝品、原料產(chǎn)生的刺激性和過敏性反應，有助于深入了解化妝品接觸性皮炎的發(fā)病原因和內(nèi)在機理。

陳晶晶等[17]以疑似化妝品過敏的患者為對象，研究了不同解剖部位斑貼試驗結(jié)果的差異，結(jié)果顯示面部皮膚較前臂和背部皮膚陽性率更高；又分析了不同部位角質(zhì)層厚度、皮脂膜質(zhì)量、pH值、經(jīng)表皮水分流失等因素對斑貼結(jié)果的影響；該研究對輔助化妝品皮膚病的診斷有指導意義，對于背部斑貼試驗結(jié)果呈陰性而又有典型化妝品皮膚病臨床癥狀者，可加試面部斑貼試驗以提高陽性檢出率。

2.3 測試人群的篩選及人群皮膚基礎(chǔ)調(diào)研

王?？〉萚8]首次對某區(qū)化妝品不良反應人群進行較完善的化妝品常見抗原系列斑貼試驗結(jié)果探討，通過大樣本量調(diào)查，建立化妝品致病成分數(shù)據(jù)庫，對于預防區(qū)域性化妝品皮膚病的發(fā)生有著積極意義。

上海市皮膚病醫(yī)院，對3 497件特殊用途化妝品斑貼試驗結(jié)果進行基礎(chǔ)研究，從類別、劑型、試驗季節(jié)、受試者性別對試驗陽性率的影響進行深層分析，比如冬季陽性率偏高、男性受試者陽性率較高等，有利于特殊用途化妝品安全性評價的規(guī)范和完善，也對斑貼試驗的結(jié)果分析有指導意義[15]。如何規(guī)避混雜因素對斑貼試驗結(jié)果的影響，對化妝品監(jiān)測管理起到重要作用[14]。

又如，化妝品人體功效測試之前，往往需要先通過斑貼試驗確定產(chǎn)品的安全性；或者針對產(chǎn)品特性，經(jīng)斑貼試驗篩選出合適的測試群體。

3 斑貼試驗的創(chuàng)新

目前為止，斑貼試驗結(jié)果主要由觀察者的視覺評價進行判定，這與其認知和經(jīng)驗有關(guān)，存有一定的主觀性。一些儀器檢測手段可對斑貼結(jié)果進行量化及描述，包括經(jīng)表皮水分流失率、皮膚顏色、表皮含水量、皮膚血流量等[18]。已有文獻證明紅斑程度和a*存在線性相關(guān)關(guān)系[19]；更有人采用Chromameter和Mexameter測定皮膚顏色，提出a*值、E值均能準確、靈敏、快速的反映微弱紅斑狀況。因儀器指標與視診判讀間相關(guān)性的研究尚少，目前暫不能代表斑貼試驗的視覺評價結(jié)果，但可作為結(jié)果判讀的輔助依據(jù)。

在化妝品領(lǐng)域，斑貼試驗對終產(chǎn)品安全性/適應性評估、配方及原料的篩選與優(yōu)化、人群皮膚基礎(chǔ)調(diào)研、化妝品皮膚病的臨床研究等方面都發(fā)揮著不可替代的作用。作為化妝品消費者，斑貼試驗對于我們明確化妝品過敏原，指導我們在日常選購、使用產(chǎn)品中避開可疑成分，有著實際而有效的意義。近年來，隨著方法的更新、材料的改進，斑貼試驗的應用范圍更加廣泛，但仍需對其封閉時間、判讀次數(shù)、影響因素等進行深入的研究，以提高診斷準確率，確保其作為評測手段的可靠性。