DNA甲基轉移酶3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風險相關性的M e ta分析

吳 雯，李 萍，左 然，

曾慶波2，4，吳德生2，謝 妮3，

龍鼎新1，*，袁建輝1，4，5，*

(1．南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽

421001；2．深圳市疾病預防控制中心毒理研究所，廣東 深圳 518055；3．深圳市第二人民醫(yī)院轉化醫(yī)學研究院，廣東 深圳 518000；

4．中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080；

5．深圳市南山區(qū)疾病預防控制中心，廣東深圳 518054)

DNA甲基化是哺乳動物基因組中最常見的表觀遺傳修飾之一，是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化作用下發(fā)生的共價修飾過程。已知有活性的DNMT有3種：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，DNMT1主要負責維持性甲基化，DNMT3A和DNMT3B主要參與從頭甲基化。在腫瘤組織中，可以觀察到DNMT3B顯著過表達，DNMT1和DNMT3A的過表達則不明顯[1-2]。

DNMT3B位于人染色體20q11.2上，有23個外顯子和22個內含子，其主要結構包括：高度可變的N-末端、PWWP結構域、鋅結合位點及具有催化功能的C-末端[3-4]。研究報道，DNMT3B啟動子區(qū)有3個多態(tài)性位點：啟動子區(qū)-283T＞C(外顯子1A為起始點)單核苷酸多態(tài)性、啟動子區(qū)-579G＞T(外顯子1B為起始點)單核苷酸多態(tài)性以及啟動子區(qū)-149C＞T單核苷酸多態(tài)性(C46359T，GenBank 登錄號 AL035071，rs2424913)，其中以DNMT3B-149C＞T多態(tài)性最為常見[5-7]。

近年來，各研究表明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能在癌癥發(fā)生中起關鍵作用。2002年Shen等[8]發(fā)現(xiàn)DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與肺癌相關。隨后DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與乳腺癌、結直腸癌、白血病等多種腫瘤易感性相關的研究陸續(xù)發(fā)表，但迄今尚未達成共識[9-11]。本文旨在利用Meta分析的方法判斷DNMT3B-149C＞T多態(tài)性和致癌風險的相關性，從而為臨床實驗及檢測提供理論依據(jù)、為個體化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

通過聯(lián)機檢索PubMed、Ovid、Embase、Web of Science、萬方數(shù)據(jù)庫、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫及中國知網(wǎng)中1990年1月1日-2017年10月31日中發(fā)表的探討DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(rs2424913C＞T)和致癌風險相關性的文獻。英文檢索策略為：(“DNA methyltransferase 3B”O(jiān)R“rs2424913”O(jiān)R“C46359T”)AND(“cancer”O(jiān)R“carcinoma”O(jiān)R“tumor”)；中文檢索為：(“DNA甲基轉移酶3B”O(jiān)R“rs2424913”O(jiān)R“C46359T基因多態(tài)性”)AND(“癌”O(jiān)R“瘤”)；未進行任何檢索限制。

1.2 文獻納入標準

本研究的文獻納入標準為：①均為觀察性研究(病例-對照研究、隊列研究)，設置癌癥組與對照組固定比較；②研究對象為與致癌風險相關的rs2424913C＞T多態(tài)性；③有關基因型或等位基因頻率的數(shù)據(jù)資料可用于評估比值比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)；④有研究開展和發(fā)表的年限。

1.3 文獻排除標準

本研究的文獻排除標準為：①采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)文獻質量評價量表的質量評價標準，對每篇文獻進行嚴格的質量評價，綜合考慮研究設計質量，排除質量過低的文獻[12]；②系統(tǒng)評價、Meta分析和其他綜述類文獻；③動物與尸體的研究類文獻。

1.4 數(shù)據(jù)提取

由兩名研究人員(吳雯和李萍)獨立審查這些文獻以排除不相關和重疊研究，使用NOS量表提取符合條件的研究數(shù)據(jù)。采用統(tǒng)一的數(shù)據(jù)收集表，用于確保數(shù)據(jù)符合上述納入標準的準確性。比較數(shù)據(jù)收集結果，對任何不一致都進行充分討論，以達成共識。每項納入研究中提取的信息有：第一作者的姓氏、出版年份、受試者的種族、癌癥類型、病例與對照的數(shù)量、基因分型方法及文獻評分。經(jīng)討論后，最終就所有提取的信息達成了共識。

1.5 統(tǒng)計分析

計算每個研究的整體OR及其相應的95%CI，以評估DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風險(純合子基因型比較CC與TT、雜合子基因型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)之間的關系。合并OR的顯著性由Z檢驗確定，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

通過Q檢驗和I2值評價各研究間異質性的大小。當I2≥50%或P＜0.10，表明各研究間異質性較高，可采用隨機效應模型，反之則采用固定效應模型分析[10]。若存在明顯異質性，通過敏感性分析依次排除單個研究尋找差異來源，排除異質性較大的研究，再次進行Meta分析合并效應值。

通過漏斗圖分析，Begg's檢驗(等級相關性檢驗)和Egger's檢驗(加權線性回歸檢驗)以圖形方式評估發(fā)表偏倚(P＜0.05表示存在顯著發(fā)表偏倚)[13]。使用Review Manager 5.0軟件和STATA version 12.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 檢索結果及納入文獻的質量評價

本文根據(jù)PRISMA(Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses)聲明編寫了研究選擇過程的詳細流程圖(圖1)[14]。根據(jù)檢索策略，共檢索到相關文獻3 039篇。剔除2 057篇重復文獻，瀏覽題目和摘要后排除867篇，按納入和排除標準全面評估，剩余30篇文獻進入最終研究，其中23項研究為英文，7項為中文(表1)[1-8，15-36]。納入的30項研究按照NOS量表的質量評價標準進行了嚴格的方法學質量評價，結果均為較高質量研究(評分＞5分)。

被納入的文獻均為觀察性研究(病例-對照研究、隊列研究)(表1)，無隨機或半隨機研究，其中5項為肺癌、3項為胃癌、3項為肝癌、3項為乳腺癌、8項為結直腸癌、8項為其他癌癥類型(白血病、食管癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部位腫瘤)。17項研究為亞洲人種，11項研究為歐美人種，1項為非洲人種，1項為混合人種。有25項研究使用了經(jīng)典的PCRRFLP方法進行實驗分析(表1)。

圖1 研究流程圖

表1 納入研究的特點

2.2 Meta分析結果

納入的30項研究顯示了DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT、雜合型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風險之間的關系，共分析了癌癥病例7 612名和健康對照9 679名。

2.2.1 CC與TT比較 圖2顯示了純合型比較(CC與TT)的相關信息。各研究間存在異質性(Phet＜0.05，I2=70.0%)，采用隨機效應模型分析，其結果顯示：OR=0.96，95%CI(0.76，1.21)，P=0.73，差異無統(tǒng)計學意義，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對所統(tǒng)計癌癥的整體致癌風險影響不大。采用依次逐個剔除納入研究的方法探討單個研究對整體結果的影響程度，敏感性分析顯示：沒有單個研究對合并的OR值造成顯著變化；整體異質性波動不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析說明Meta分析結果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進行亞組分析(表2)，在肺癌組[OR=1.51，95%CI(1.08，2.12)，P=0.02；I2=47.0%]有統(tǒng)計學意義。在胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌及其他癌癥組，均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對上述癌癥風險影響不大。按種群進行亞組分析(表2)，未能在亞洲和高加索人群中檢測到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型與致癌風險之間存在顯著關聯(lián)。按研究方法進行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對致癌風險的作用。

圖2 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT)與致癌風險相關性的森林圖

2.2.2 CT與TT比較 圖3顯示了雜合型比較(CT與TT)的相關信息。各研究間存在異質性(Phet＜0.05，I2=67.0%)，采用隨機效應模型分析，其結果顯示：OR=1.05，95%CI(0.86，1.28)，P=0.65，差異無統(tǒng)計學意義，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對所統(tǒng)計癌癥的整體致癌風險影響不大。采用依次逐個剔除納入研究的方法探討單個研究對整體結果的影響程度，敏感性分析顯示：沒有單個研究對合并的OR值造成顯著變化；整體異質性波動不大(Phet＜0.05，I2＞62.0%)。以上分析說明Meta分析結果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進行亞組分析(表2)，在肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌及其他癌癥組，均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對上述癌癥風險影響不大。按種群進行亞組分析(表2)，未能在亞洲和高加索人群中檢測到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型與致癌風險之間存在顯著關聯(lián)。按研究方法進行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對致癌風險的作用。

圖3 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(雜合型比較CT與TT)與致癌風險相關性的森林圖

2.2.3 CC+CT與TT比較 圖4顯示了顯性遺傳型比較(CC+CT與TT)的相關信息。各研究間存在異質性(Phet＜0.05，I2=69.0%)，采用隨機效應模型分析，其結果顯示：OR=1.00，95%CI(0.82，1.22)，P=0.98，差異無統(tǒng)計學意義，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對所統(tǒng)計癌癥的整體致癌風險影響不大。采用依次逐個剔除納入研究的方法探討單個研究對整體結果的影響程度，敏感性分析顯示：沒有單個研究對合并的OR值造成顯著變化；整體異質性波動不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析說明Meta分析結果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進行亞組分析(表2)，在肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌組及其他癌癥組，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對上述癌癥風險影響不大。按種群進行亞組分析(表2)，在亞洲和高加索人群中的DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型與致癌風險之間不存在顯著關聯(lián)。按研究方法進行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對致癌風險的作用。

2.3 發(fā)表偏倚

DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT、雜合型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風險相關性的漏斗圖見圖5～6，漏斗圖的視覺檢查未發(fā)現(xiàn)實質性的不對稱性，而Begg秩相關法和Egger回歸法均未顯示發(fā)表偏倚(表2)。

圖4 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風險相關性的森林圖

圖5 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT)與致癌風險相關性漏斗圖

3 討論

DNA的異常甲基化模式已在多種人類腫瘤中被揭示，腫瘤細胞中DNA甲基化異常主要表現(xiàn)為特定基因位點的高甲基化和基因組的整體低甲基化，這已成為腫瘤的重要表觀遺傳學變異特征之一。DNA甲基轉移酶家族(DNMTs)在維持和催化DNA甲基化過程中起到重要的作用，哺乳動物中DNA甲基化的從頭合成催化過程主要以DNMT3B為主[30]。Ho等[37]研究表明DNMT3B基因編碼區(qū)甲基化增加與結直腸腺瘤的發(fā)病幾率呈正相關OR=1.34；95%CI(1.01，1.79)，由于結直腸腺瘤是結直腸癌的癌前病變，這就為早期發(fā)現(xiàn)癌變及腫瘤治療提供了新的方向。Lin等[38]研究表明DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三種蛋白在肺癌組織中協(xié)同高表達，且DNMT3B高表達與抑癌基因的高甲基化明顯相關(P=0.012)，提示DNMT3B在肺癌的發(fā)生中起重要作用。DNMT3B基因的高表達使患癌風險增加，其原因可能是通過調節(jié)其他基因的甲基化狀態(tài)來發(fā)揮作用。

圖6 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風險相關性漏斗圖

表2 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風險之間相關性的亞組分析

單核苷酸多態(tài)性(SNPs)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上[16，32]。研究表明，基因啟動子區(qū)的變異不僅會影響基因表達、還會影響酶的活性，從而增加致癌風險[6-7]。目前已有多篇DNMT3B基因啟動子區(qū)C46359T多態(tài)性與肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤易感性相關的研究報道。2002年Shen等[8]研究顯示在肺癌中，DNMT3B啟動子區(qū)-149位SNP位點的C＞T轉換使轉錄活性增加30%，使mRNA表達和酶活性增加，認為其增加了肺癌的易感性。李淵等[15]研究發(fā)現(xiàn)正常人中CT基因型發(fā)生急性白血病的危險性是TT基因型的4.669倍，提示DNMT3B-149C＞T多態(tài)性是一種可能的腫瘤預測等位基因。

本文采用Meta分析方法，綜合近30年國內外公開報道的研究結果表明，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與所統(tǒng)計癌癥的整體致癌風險無關，這與已有研究[9-11]報道的結果基本一致。這一結果產(chǎn)生的可能原因為：①癌癥是一種復雜的疾病，受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能不是癌癥風險的獨立誘發(fā)因素；②采取了全面檢索已發(fā)表的研究文獻、使用嚴格的納入及排除標準、精確的數(shù)據(jù)提取與分析等一系列降低異質性的手段后，仍舊存在異質性；③不同類型癌癥的發(fā)病機制不同，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能只參與部分癌癥的發(fā)生與發(fā)展。

按照不同癌癥類型進行亞組分析時，我們發(fā)現(xiàn)DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型與肺癌致病風險有關，且與CC基因型相比，TT基因型增加了患肺癌的風險。本文未得到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與其他癌癥有關聯(lián)的結果，可能是不同類型的癌癥具有不同的起始和進展機制，此多態(tài)性在不同的癌癥類型中作用有所不同，且本文納入的各類癌癥研究文獻數(shù)量有限。分別按種群和研究方法進行亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)異質性來源與種群和研究方法均無關。鑒于DNMT3B可能在腫瘤發(fā)生過程中起致癌作用；且在生物學上，DNMT3B多態(tài)性可能通過增加啟動子活性，來調節(jié)某些腫瘤抑制基因中CpG島的重新甲基化[30]。研究這種多態(tài)性，可能有助于我們更好地了解腫瘤的生物學行為，預測腫瘤的遺傳易感性以及選擇適宜的個體療法。

本次Meta分析也存在著一些局限性：①同種癌癥相關的文獻數(shù)量較少，可納入的樣本量較小，無法由小樣本量的研究推及可信的整體結論，由于樣本量有限和/或種族差異，無法由個別研究結果推出可靠的總體結論；②不同癌癥具有不同的病理類型，如小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌等，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性在不同病理類型發(fā)揮的作用可能有差異；③納入的原始文獻中的研究對象有關信息(如飲食習慣、環(huán)境因素等)無法提取，因此無法對混雜因素進行亞組分析；④不同納入文獻的研究者進行實驗和數(shù)據(jù)處理時，所依據(jù)的操作標準會有所不同，也會造成偏倚。

綜上所述，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能是肺癌易感性因素；DNMT3B基因啟動子區(qū)-149位TT基因型發(fā)生肺癌的危險性明顯高于CC基因型。由于本次研究存在諸多的局限性，尚待更多高質量、大樣本循證醫(yī)學證據(jù)的出現(xiàn)，來進一步證實這一結論。