Skp1蛋白在非小細胞肺癌組織和外周血中的表達水平及其臨床意義

朱嘉微，胡 簫，王希君，王雅茹，馮 林，肖 汀*

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室，癌發(fā)生及預防分子機理北京市重點實驗室，北京 100021)

目前肺癌仍是世界上癌癥死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%。雖然目前針對肺癌的早期篩查手段越來越多，但多數NSCLC患者(約占75%)在確診時已經處于中晚期，其癌組織已經發(fā)生轉移，即使通過手術切除，患者預后仍不樂觀[1]。研究顯示，大部分中晚期NSCLC患者的中位生存期為8～12個月[2]。因此，我們需要綜合評估中晚期NSCLC患者的預后，找到中晚期NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關基因，從而篩選出潛在的預后評估指標。

在過去的十年間，泛素蛋白酶體系統(tǒng)已經成為開發(fā)新型抗癌療法的有效藥物靶點[3-5]。泛素蛋白酶體途徑是蛋白質水解的主要途徑。泛素級聯反應由一系列酶如E1、E2和E3催化而成，其中E3泛素連接酶負責靶蛋白的選擇[6-7]。泛素連接酶復合物(Skp1-Cullin-F-box，SCF)是由穩(wěn)定亞基Skp1、Cul1、環(huán)指蛋白ROC/Rbx1和可變F-box共4部分組成[8]。S期激酶相關蛋白1(S-phase kinase-associated protein 1，Skp1)是SCF泛素連接酶復合體的特異性底物識別亞單位F-box家族的成員之一，在胚胎、宮頸、淋巴細胞、成骨細胞等不同類型的細胞和組織中普遍表達[9]。Skp1可以穩(wěn)定F-box蛋白、增強底物結合能力[10]、參與細胞周期調控[11]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[12]。已有研究證明SCF復合物在腫瘤的發(fā)生中起著關鍵作用，并且一些F-box蛋白已被證明是治療人類癌癥的潛在靶點[13]。然而，關于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否可以作為肺癌治療靶點仍待進一步研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白水平，分析其與NSCLC臨床病理指標及患者預后的關系，為Skp1在臨床上的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

本研究所用組織芯片共包含非小細胞肺癌及其癌旁組織樣本各86例，其中用于Western blot檢測的NSCLC及其配對的癌旁樣本各34例。本研究用于ELISA實驗的NSCLC血漿樣本39例。上述樣本均來自于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院胸外科2014年7月—2016年10月收治的患者，隨訪時間截止為2018年12月。本研究中ELISA試驗所用健康人血漿樣本共27例，來自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院體檢人群。所有樣本均取得研究對象的知情同意。

1.2 主要試劑

Skp1小鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；β-actin小鼠單克隆抗體購于英國Abcam公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(Western blot)、蛋白提取試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司；蛋白定量試劑盒(BCATMprotein Assay Kit)購于Thermo Fisher公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(免疫組化用)、20×DAB顯色試劑盒購于MaxVision公司；封閉用正常山羊血清購于北京索萊寶科技有限公司；10×檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)、蘇木素染料均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；H2O2和氨水購于北京化工廠；Skp1 ELISA試劑盒購于Aviva Systems Biology公司。

1.3 Western blot實驗

取NSCLC組織及相應癌旁組織樣本各34例置于蛋白提取液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)中，用勻漿器攪碎，使其充分裂解，離心，收集上清蛋白；蛋白濃度測定，繪制標準曲線；蛋白變性、定量后電泳(80 V，30 min；120 V，溴酚藍指示)；轉膜(250 mA，120 min)；封閉(3%脫脂牛奶，2 h)；孵育一抗(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶200稀釋；β-actin小鼠單克隆抗體，1∶4 000稀釋)作用2 h；洗脫，孵育二抗(山羊抗鼠，1∶5 000)作用1 h；曝光成像。

1.4 免疫組化實驗及結果判定

將86例NSCLC組織及相應癌旁組織芯片置于烤箱中，65℃、烘烤5 h；組織芯片經脫臘、水化后置于3%H2O2溶液中，室溫、避光孵育10 min以去除細胞內源性過氧化物酶的活性；后經1×檸檬酸鹽進行抗原修復，正常山羊血清室溫封閉15 min，棄去封閉液，用一抗工作液(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶100稀釋)4℃孵育過夜；之后，二抗室溫孵育20 min；DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色強度；蘇木素染色；脫水；中性樹脂封片，顯微鏡下掃描觀察。

結果判定：免疫組化染色結果由兩位臨床病理醫(yī)師獨立判讀，根據細胞染色強度和陽性細胞所占比例進行綜合分析。其中細胞染色強度的評分標準為：0分(無黃棕色顆粒)，1分(淡黃色顆粒)，2分(棕黃色顆粒)，3分(褐色顆粒)；陽性細胞比例的評分標準為：0分(陽性細胞比例≤5%)，1分(5%＜陽性細胞比例≤25%)，2分(25%＜陽性細胞比例≤50%)，3分(50%＜陽性細胞比例≤75%)，4分(75%＜陽性細胞比例≤100%)。結果取兩者之積，分4個等級：0分記為(-)，1～4分記為(+)，5～8分記為(++)，9～12分記為(+++)[14]。最終將(-)和(+)定為蛋白低表達，將(++)和(+++)定為蛋白高表達。

1.5 ELISA方法

按照Skp1 ELISA試劑盒說明書來操作，包括梯度稀釋標準品；加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，依次加入100μL不同濃度的標準蛋白、血漿樣品、標準蛋白稀釋液；37℃孵育1 h；棄去液體；每孔加入100μL Biotinylated Skp1 Detector Antibody工作液，37℃孵育1 h；棄去液體，每孔加入300μL洗滌液洗滌，重復3次；每孔加入100μL Avidin-HRP結合工作液，37℃孵育30 min；棄去孔內液體，洗滌液洗板5次；每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色30 min；每孔加入終止液50μL，終止反應，用酶標儀檢測各孔的D(450)值。

1.6 數據分析

使用Image J 1.8.0圖像軟件進行Western blot條帶灰度值處理；采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。本研究中，患者的預后(disease-free survival，DFS)隨訪期為患者首次手術日期至發(fā)生復發(fā)、轉移或隨訪結束日期，用月計算。分別采用卡方檢驗和非配對T檢驗分析肺癌組織和外周血中Skp1的表達與各臨床指標之間的關系；采用Kaplan-Meier方法繪制肺癌患者的生存曲線，并進行Log-rank檢驗；采用多因素Cox回歸分析研究風險因素。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

Western blot檢測34例NSCLC組織及相應癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平如圖1A所示，結果顯示Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，見圖1B。

圖1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織和癌旁組織中的表達

2.2 免疫組化法檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

免疫組化法檢測86例NSCLC組織及癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平，結果顯示Skp1陽性表達主要定位于NSCLC細胞的細胞漿，呈棕黃色顆粒彌漫分布在細胞漿中(圖2)。Skp1蛋白在NSCLC組織中呈陽性高表達，陽性表達率為47.7%(41/86)，Skp1蛋白在癌旁組織中低表達，陽性表達率為10.5%(9/86)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結轉移、分化程度等因素無顯著相關關系(P＞0.05)，見表1。

圖2 免疫組織化學染色檢測Skp1蛋白在NSCLC組織及癌旁組織中的表達

表1 NSCLC組織中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標之間的關系

2.3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

ELISA檢測Skp1在39例NSCLC患者血漿及27例健康人血漿中的蛋白水平，結果顯示Skp1在NSCLC患者血漿中的蛋白濃度顯著高于健康人群(P=0.003)(圖3)。以所有受試人群外周血中Skp1蛋白濃度的中位數(90.65 pg/mL)為臨界點，將受試人群分為兩組，分別為：Skp1低水平組(＜90.65 pg/mL)和Skp1高水平組(≥90.65 pg/mL)。統(tǒng)計學分析顯示Skp1蛋白在非小細胞肺癌外周血中的表達水平與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結轉移、分化程度等因素無顯著相關關系(P＞0.05)。Skp1蛋白在NSCLC患者外周血中的表達水平與各臨床參數之間的關系見表2。

圖3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

表2 NSCLC患者外周血中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標之間的關系

2.4 Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與患者預后的關系

本研究中共79例NSCLC患者有相應的預后信息(復發(fā)轉移及生存情況)，其中包含35例早期(I)患者，44例中晚期(II+III)患者；37例低分化患者，42例高中分化患者。隨訪時間3～54個月，中位隨訪時間34個月。用Kaplan-Meier預后分析表明，在早期(I)NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達和低表達患者間預后差異不顯著(P=0.140，圖4A)，而在中晚期(II+III)患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者預后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.001，圖4B)。在分化程度比較低的NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.004，圖4C)。而在分化程度比較高的NSCLC患者中，則差異不顯著(P=0.699，圖4D)。多因素Cox回歸分析結果顯示，Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預后的獨立危險因素(P=0.006，表3)。

圖4 Kaplan-Meier生存分析組織中Skp1蛋白表達水平與NSCLC患者預后的關系(n=79)

3 討論

非小細胞肺癌是一種高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤。尤其處于中晚期的肺癌患者，即使通過手術切除，患者復發(fā)轉移、死亡的幾率依舊很高。因此，我們需要進一步找到中晚期NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關基因，從而篩選出潛在的預后指標，為臨床評估提供一定的理論依據。

近幾年的研究發(fā)現，SCF泛素連接酶復合體(Skp1-Cullin-F-box)可以通過泛素依賴的蛋白水解途徑降解細胞周期相關蛋白，參與細胞增殖與凋亡的調控，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。Yu等[16]研究發(fā)現Skp1/Skp2/Cul1復合體可以選擇性的靶向p21和cyclin D蛋白，并進行泛素化降解，該復合體的異常表達可能會調控G1期細胞周期調控因子的蛋白表達水平，進而參與腫瘤的形成過程。Hussain等[5]在肺癌中的研究結果表明干擾Skp1基因的表達能明顯抑制肺癌細胞的生長、增殖、克隆活性和G2/M期阻滯，表明Skp1與肺癌發(fā)生發(fā)展和患者生存密切相關。此外，將Skp1從F-box中分離出來會引起F-box相關蛋白(ALK/NIPA、Skp2和TRCP)的降解，進一步表明Skp1表達水平的升高可能會促進SCF連接酶的致癌活性。Cul1在黑色素瘤、乳腺癌和肺癌中高表達，促進癌細胞的增殖，并且Cul1的高表達與腫瘤患者的不良預后有關[17-18]。含β-轉導素重復的E3泛素蛋白連接酶(betatransducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)通過介導泛素化途徑降解IkBα從而激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，增強β-catenin轉錄活性[19]。大量研究發(fā)現Skp2基因與肺癌的侵襲、浸潤、淋巴結轉移和患者預后顯著相關。Wang等[20]在黑色素瘤細胞中的研究顯示Skp2能通過介導MutT同源物1(MutT homolog 1，MTH1)的穩(wěn)定性，抑制氧化應激引起的DNA損傷和細胞凋亡，進而促進黑色素瘤細胞的生存。Takanami等[21]用RT-PCR和免疫組織化學染色方法研究了79例NSCLC組織標本Skp2的表達水平與臨床參數及預后的關系，發(fā)現Skp2與病理分期、組織學亞型、血管侵襲、淋巴結轉移等因素顯著相關，并且Skp2高表達的NSCLC患者生存率顯著偏低。此外，多因素COX分析表明Skp2是肺癌患者預后的獨立危險因素，提示其可作為NSCLC侵襲性強和不良預后的潛在指標。Zhang[22]和Ding等[23-24]研究發(fā)現Skp2是骨肉瘤的一個潛在治療靶點，Skp2在骨肉瘤細胞中高表達，并且其高表達與骨肉瘤患者的不良預后有關，干擾Skp2基因表達能夠減少骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，降低體內肺轉移。Wang等[13]研究發(fā)現致癌性E3連接酶通過降解腫瘤抑制因子使細胞無限增殖、基因組不穩(wěn)定，從而發(fā)生細胞惡性轉化。

表3 多因素Cox回歸分析臨床指標和Skp1蛋白表達水平與中晚期(II+III)NSCLC患者預后的關系

越來越多的實驗和研究證明，在人類多種癌癥中，SCF復合物，包括核心組分(Cul1和Rbx1)和受體組分(Skp2和β-TRCP等)的差異過表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和患者不良預后密切相關[25-27]。然而，關于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否和SCF其他組分一樣與肺癌患者預后相關，以及是否可以作為肺癌治療靶點仍有待研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白表達水平，分析探索其與NSCLC臨床病理指標及患者預后的關系，為Skp1在臨床上的應用提供一定的理論依據。我們本次的研究發(fā)現Skp1也有類似的現象，本研究通過Western blot、免疫組化和ELISA分別檢測了Skp1在NSCLC和正常人組織及外周血中Skp1蛋白的表達水平，發(fā)現Skp1蛋白在NSCLC中顯著高表達(P＜0.01)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示，在中晚期(II+III)NSCLC患者以及低分化NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預后均顯著差于Skp1低表達的患者(P＜0.01)，多因素Cox回歸分析顯示Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預后的獨立危險因素(P＜0.01)。這提示著Skp1基因可能作為癌基因參與到NSCLC的進程，并且NSCLC惡性程度越高Skp1影響越顯著。雖然研究已經發(fā)現Skp1在NSCLC患者中異常表達，并且可能作為癌基因參與NSCLC發(fā)生發(fā)展的進程，但仍有很多生物學功能方面的問題需要解答：Skp1是通過什么信號傳導機制結合到F-box蛋白上，其異常表達又是如何影響SCF復合體的致癌性；Skp1在機體又是受什么信號誘導發(fā)生異常表達，進而參與癌癥進程等，有待進一步的細胞功能學實驗驗證和研究。相較于其他分子而言，目前對于Skp1的研究卻很少，值得我們進一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現Skp1蛋白在NSCLC患者組織和外周血中顯著高表達，并且其在NSCLC組織中的高表達與患者的不良預后顯著相關，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關鍵分子，這提示Skp1蛋白有望成為中晚期(II+III)NSCLC患者診斷和預后的生物標志物和治療靶點。