回歸正交設(shè)計(jì)對(duì)密蒙花總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化建模

黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000

密蒙花為馬錢(qián)科醉魚(yú)草屬植物密蒙花(BuddleiaofficinalisMaxim.) 的干燥花蕾和花序[1]，又稱(chēng)做黃飯花、染飯花、小錦花、雞骨頭花等，是一種常用中藥，主要用于目赤腫痛、多淚澀明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花等癥[2]。在貴州黔東南地區(qū)，每逢過(guò)節(jié)有用密蒙花新鮮或干燥花蕾和花序的水浸液染糯米飯食用的習(xí)俗。文獻(xiàn)報(bào)道[3]，密蒙花的主要活性成分為黃酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、三萜及其皂苷類(lèi)化合物，其中黃酮類(lèi)化合物是密蒙花的主要活性成分之一，現(xiàn)代研究表明[4-5]，密蒙花中的黃酮類(lèi)成分達(dá)11種，具有抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等作用。有關(guān)黔東南地區(qū)密蒙花中黃酮類(lèi)成分提取工藝及其在醫(yī)藥行業(yè)中利用價(jià)值的開(kāi)發(fā)研究比較少，本研究采用二次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲提取密蒙花總黃酮成分的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為密蒙花資源的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 UV8000S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，潔康超聲波清洗器(潔康超聲波設(shè)備有限公司) ，MS204S型電子分析天平( 梅特勒托利多(上海)儀器有限公司)。

1.2 材料與藥品 密蒙花采自黔東南州境內(nèi)，曬干，粉碎后備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：Y19N7S25244，上海源葉生物科技有限公司)，無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品總黃酮提取液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取密蒙花粗粉1.0 g若干份，置具塞錐形瓶中，加25 mL石油醚，超聲提取15 min，濾過(guò)，棄去石油醚液，藥渣晾干后，按單因素試驗(yàn)及正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，加一定倍量和濃度的乙醇，超聲提取，將提取液過(guò)濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇定容，即得密蒙花總黃酮提取液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 稱(chēng)取10℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定溶到50 mL容量瓶中，搖勻，得0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別放入20 mL 的容量瓶中，先各加入5 %NaNO2溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min后，分別加入10 %Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min后，再分別加入4 %的NaOH 溶液5 mL，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，在510 nm 處測(cè)定吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并擬合蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為： A=0.005+11.892C(r=0. 999) ，表明黃酮在0.000～0.030 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度A呈線(xiàn)性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

1.3.3 總黃酮含量計(jì)算 精密吸取密蒙花總黃酮提取液0.5 mL置于20 mL容量瓶，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510 nm 處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，求出相當(dāng)于樣品吸光度的蘆丁濃度，按下式計(jì)算總黃酮含量：

式中C為樣品中黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為黃酮溶液的體積50 mL，稀釋倍數(shù)為40倍，m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 按表1設(shè)計(jì)的因素水平超聲提取，分別考察單因素乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間對(duì)密蒙花總黃酮含量的影響。

表1 單因素試驗(yàn)因素及水平

1.3.5 回歸正交組合試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響密蒙花總黃酮含量的三因素，乙醇濃度(x1)，固液比(x2)、提取時(shí)間(x3)進(jìn)行二次回歸正交組合試驗(yàn)。由于因素?cái)?shù)m=3，二水平試驗(yàn)次數(shù)mc=8，星號(hào)試驗(yàn)次數(shù)mr=2m=6，零水平試驗(yàn)次數(shù)m0=3，根據(jù)星號(hào)臂長(zhǎng)公式計(jì)算，得r=1.353。因素水平編碼如表2 所示 。按“1.3.2”節(jié)法測(cè)定密蒙花總黃酮含量。

表2 回歸正交組合因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn) 取蘆丁對(duì)照品溶液，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次，吸光度的RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510 nm波長(zhǎng)處，按0、1、2、4、6、8 h不同時(shí)間間隔測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度的RSD為1.22%，表明供試樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取6份同樣的樣品約1.0 g，按樣品溶液制備方法處理，“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.04%，表明測(cè)定方法重復(fù)性好。

2.4 加樣回收試驗(yàn) 稱(chēng)取6份已知含量的密蒙花藥材粉末約0.5 g，分別加入蘆丁對(duì)照品適量，按樣品溶液制備方法處理，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，平均回收率為101.46%，RSD為2.31%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 提取溶劑乙醇濃度的影響 隨著乙醇濃度的升高，密蒙花中黃酮含量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮含量最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，含量反而下降。如圖2所示。

2.5.2 固液比的影響 料液比為1∶40時(shí)，黃酮含量最高，但隨著溶劑用量的增加，黃酮含量呈下降趨勢(shì)，因此，不需要繼續(xù)提高溶劑用量。如圖3所示。

2.5.3 提取時(shí)間的影響 由圖4可見(jiàn)，提取時(shí)間為30 min時(shí)，黃酮含量最高，當(dāng)再延續(xù)提取時(shí)間，黃酮含量明顯下降。如圖4所示。

2.6 回歸正交組合試驗(yàn) 按照表2安排的試驗(yàn)水平進(jìn)行超聲提取，按照三元二次回歸正交組合設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，得出密蒙花中總黃酮含量(Y)與各因素間的回歸方程為：

(1)

回歸方程(1)式中b0的計(jì)算式為：

(2)

第二次顯著性測(cè)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4))顯示，方程(2)式F回=6.65>F0.01，二次回歸方程在α=0.01時(shí)，達(dá)極顯著水平，此方程可作為提取密蒙花中總黃酮數(shù)字模型的基本方程式。

表4 二次回歸正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)回歸關(guān)系方差分析

表6 總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)回歸關(guān)系第二次方差分析

2.7 模型尋優(yōu) 對(duì)剔除不顯著項(xiàng)變量后的回歸方程(2)式求一階偏導(dǎo)數(shù)，解方程組得x1=-0.453 5,x3=-0.221 2。將x1和x3代入原編碼水平，得出各因素的最優(yōu)試驗(yàn)水平為x1=53.30≈54,x3=32.5≈33。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果可知，因素x1(乙醇濃度)和因素x3(固液比)對(duì)提取物中總黃酮含量有影響，而x2(提取時(shí)間)的影響不顯著，綜合考慮，取x2=r=1.353，代入原編碼水平計(jì)算得。即最佳的提取工藝條件是用33倍量54%的乙醇超聲提取密蒙花40 min。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證(n=3)，提取物中總黃酮含量平均值為70.13 mg/g，表明所確定的最佳提取工藝合理可行。

3 結(jié)論

回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是把正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、回歸數(shù)據(jù)處理和回歸精度統(tǒng)一起來(lái)的回歸設(shè)計(jì)與分析方法，兼?zhèn)淞苏辉O(shè)計(jì)與回歸分析兩者的優(yōu)點(diǎn)。不僅可以找到與試驗(yàn)點(diǎn)較為貼近的數(shù)學(xué)模型，而且減少了試驗(yàn)次數(shù)，數(shù)據(jù)分析上的計(jì)算也很簡(jiǎn)潔，對(duì)實(shí)際應(yīng)用有很好的指導(dǎo)意義。利用超聲法提取密蒙花總黃酮具有提取率高，縮短提取時(shí)間，并且避免高溫對(duì)黃酮類(lèi)成分的破壞。本試驗(yàn)以提取物中總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)，確定密蒙花中總黃酮含量的最佳提取工藝條件為乙醇濃度54%，固液比1∶33(g：mL)，提取時(shí)間40 min，在此條件下提取的黃酮含量達(dá)70.13 mg/g。并擬合出了密蒙花總黃酮提取與各因素變量的回歸方程數(shù)字模型，模型擬合較好，達(dá)極顯著水平，有一定的應(yīng)用價(jià)值。