太子參均一多糖對大鼠小腸α-糖苷酶活性影響

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1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

國內(nèi)多名學(xué)者的研究結(jié)果表明太子參多糖具有抗糖尿病作用[1-3]。課題組前期，以閩產(chǎn)柘榮太子參為原料，提取粗多糖，醇沉得到分子量分布不同太子參多糖的四個級分區(qū)，并將四個級分區(qū)分別對1型及2型糖尿病大、小鼠進行抗糖尿病藥效對比實驗。結(jié)果表明50～200kDa分子量段的多糖可顯著降低2型糖尿病大鼠血糖，改善糖尿病一般癥狀[4]。進而采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠柱聯(lián)用將太子參多糖抗2型糖尿病有效部位進行分級、純化，獲得均一多糖HPH-1-2及HP0.5MSC-F；集成UV、IR、NMR等多種波譜分析技術(shù)，表征其化學(xué)結(jié)構(gòu)；通過體外細胞實驗證明太子參均一多糖PHP0.5MSC-F及PHPH-1-2具有降糖活性[5-6]。本研究從大鼠小腸中分離α-糖苷酶，采用pNPG法、ELISA檢測，考察太子參均一多糖對α-糖苷酶活性影響，探討其降血糖途徑[7]。

1 儀器與材料

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠(200±5)g(上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2017-005)；HP0.5MSC-F、HPH-1-2，純度大于95%。

1.2 試劑 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(批號：BCBH2918V，sigma公司)；磷酸氫二鈉(分析純，批號：20120330，國藥試劑)；二甲基亞砜(批號：SHBB9317V，sigma公司)；磷酸二氫鈉(分析純，批號：141121，國藥試劑)。

1.3 儀器 YP502N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AE240S分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DK-420S水浴鍋(上海精密實驗設(shè)備有限公司)；GNP-9080 恒溫培養(yǎng)箱(上海精密實驗設(shè)備有限公司)；UV-3200紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；Varioskan Flas多功能酶標儀(美國熱電公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理 由大鼠分離小腸α-糖苷酶，以對硝基酚-α-葡萄糖苷(pNPG)為底物，利用α-葡萄糖苷酶將其分解成pNP及葡萄糖，而pNP在堿性條件下顯色的原理測定酶活力[8]。

2.2 實驗步驟

2.2.1 磷酸鹽緩沖液的配制 精密稱取NaH2PO4·2H2O 15.7981 g，Na2HPO4·12H2O 35.7990 g，分別超聲溶解，定容至100 mL，混勻，得到1M磷酸鹽貯存液。分別取貯存液NaH2PO454 mL，Na2HPO446 mL，定容至1 L，即得pH=6.8 0.1 M磷酸緩沖鹽溶液。

2.2.2 酶的提取 大鼠禁食不禁水12 h后，脫頸椎處死，立即取出小腸，用冷生理鹽水沖洗，翻轉(zhuǎn)小腸后再漂洗，將洗凈的小腸置于培養(yǎng)皿上，用載玻片輕刮下小腸黏膜。加入適量的 4℃ pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，勻漿后于 4℃，20 000 g/min離心20 min，沉淀加適量的 4℃ pH=6.8的磷酸鹽緩沖液搖勻后，20 000 g/min離心20 min ，合并上清液，加磷酸鹽緩沖液稀釋至20 mL/每只大鼠，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 底物溶液的配制 精密稱取0.015 03 g 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷，加入少量緩沖鹽溶液，超聲溶解，以緩沖鹽溶液定容至25 mL。

2.2.4 阿卡波糖溶液的配制 精密稱取阿卡波糖12.86 mg，加DMSO 50 μL超聲溶解，純水定容至10 mL。即得2 000 μmol/L阿卡波糖溶液。去上述溶液500 μL，純水定容至10 mL。即得100 μmol/L阿卡波糖溶液。

2.2.5 試樣對α-糖苷酶抑制率 試驗依次將磷酸鹽緩沖液、試藥入到96孔板內(nèi)，復(fù)孔3孔，37℃孵育10 min，實驗組加入30 μL 底物溶液，混勻，37 ℃ 反應(yīng)30 min后，隨后立即測定405 nm吸光度。

2.2.6 藥物對α-糖苷酶抑制率的計算方法 將實驗各組所得OD值代入下式計算太子參均一多糖對α-糖苷酶抑制率。實驗重復(fù)3次，所得實驗結(jié)果以平均值表示。抑制率的計算公式如下：

2.3 結(jié)果 當阿卡波糖濃度為55 μmol/L時，其對大鼠小腸α-糖苷酶的抑制率為50.18%，表現(xiàn)出對大鼠小腸α-糖苷酶強抑制活性；HP0.5MSC-F、HPH-1-2、在濃度為400 μmol/L時其抑制率依次為19.00%、27.43%。見表1。

表1 PHP0.5MSC-F和PHPH-1-2對α-糖苷酶的抑制作用 (n=3)

3 討論

源于飲食的糖類化合物分解代謝是由一系列糖苷水解酶在小腸中完成的，這些酶包括直鏈淀粉酶、蔗糖酶及乳糖酶；酶水解產(chǎn)物主要為葡萄糖，透過小腸壁主動吸收進入血液循環(huán)。對糖尿病人，減少葡萄糖吸收量從而阻抑血糖濃度的快速升高是一條十分重要的治療途徑。阿卡波糖就是糖水解酶抑制劑，阻止餐后血糖升高，療效確切、副作用小，臨床廣泛應(yīng)用；本研究考察太子參均一多糖對大鼠小腸α-糖苷酶活性影響，從一個側(cè)面探討太子參多糖的降血糖途徑。但實驗中所用底物pNPG溶液室溫下易水解變質(zhì)，配置后應(yīng)放于4℃冰箱保存。

本研究以阿卡波糖作為陽性對照，ELSA法檢測太子參均一多糖對α-糖苷酶的抑制作用。PHP0.5MSC-F和PHPH-1-2兩種太子參均一多糖對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。