當(dāng)歸補(bǔ)血湯對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠空間記憶能力的影響

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1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州省骨科醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

目前我國已逐步邁進(jìn)老齡化社會時(shí)期。據(jù)中國國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，中國60歲及以上人口將由2016年的2.3億余逐步增加至2050年的4.8億余，屆時(shí)，約占40%的亞洲老年人口，25%的全球老年人口。衰老的一個(gè)主要特征就是學(xué)習(xí)記憶功能下降，分為器質(zhì)性健忘和功能性健忘兩類。生理性健忘多與年齡相關(guān)，臨床上尤以40～60歲的人最為多見，且近年來隨著社會壓力的增加呈年輕化趨勢；器質(zhì)性健忘多由腦神經(jīng)血管性疾病造成，以老年癡呆為代表，在整個(gè)人群中發(fā)病率達(dá)4%～5%[1]。

中醫(yī)認(rèn)為，機(jī)體記憶力和腦髓功能關(guān)系密切，“小兒善忘，腦未滿也；老人健忘，腦漸空也”，“著腦為元神之府，靈機(jī)記性在腦”(《醫(yī)林改錯(cuò)》)。而腦髓的生成與其功能的正常運(yùn)行需要“精與血”的濡養(yǎng)。《靈樞經(jīng)脈》云：“人始生，先成精，精成而腦髓生。” 《景岳全書·血證》云：“血即精之屬也，但精藏于腎，所蘊(yùn)不多，而血富于沖，所至皆是”。血液在腎中與腎精相合，為腎所藏之(陰)精，機(jī)體血盛則精旺，血虛則精枯。“腎，主骨，生髓”出自《素問·陰陽應(yīng)象大論》。腎所藏之精可以生髓，而腦為髓之海，若腎(陰)精虧損不能生髓，則髓海漸失所養(yǎng)，進(jìn)而引發(fā)記憶衰退、思維遲鈍等。因此，基于精、血、髓之間的聯(lián)系，一是血能直接充養(yǎng)腦髓，二是血能生精，精能化髓，血具有補(bǔ)養(yǎng)腦與髓的雙重作用。中醫(yī)認(rèn)為氣血是腦部執(zhí)行各種生理機(jī)能的物質(zhì)基礎(chǔ)，腦部疾病主要病機(jī)之一便是“氣血虧虛”，因此，“補(bǔ)氣生血”是治療腦部疾患的基本方法。Morris 水迷宮(Morris water maze, MWM)廣泛用于大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的評價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究[2-3]。本研究擬采用Morris水迷宮法觀察補(bǔ)氣生血法代表方劑——當(dāng)歸補(bǔ)血湯對衰老大鼠模型的記憶能力的影響。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 清潔級雄性SD大鼠，(200±20)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(湘)2014-0011，合格證編號：43006700013547)。篩選出50只達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，隨機(jī)分為5組，分別為：正常組、模型組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組(2 g/kg)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組(4 g/kg)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(8 g/kg)。

1.2 藥品 D-半乳糖(批號：210E052，北京索萊寶科技有限公司)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥材出自《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1比例組成。組方藥材購自貴陽中醫(yī)學(xué)院一附院，黃芪500 g：當(dāng)歸100 g，加純水浸泡30 min，煎煮30 min，過濾，濾渣加純水適量，繼續(xù)煎煮30 min，合并濾液，將其濃縮為300 mL母液(濃度為2 g/mL)，備用。

1.3 儀器 DNS-2型動物神經(jīng)精神行為測定：Morris水迷宮由不銹鋼水池(圓柱狀)、可移動平臺和圖像自動采集、處理系統(tǒng)等組成。MH30002C精密電子天平(上海茂宏電子科技有限公司)。

1.4 定位航行試驗(yàn) Morris水迷宮主要用于實(shí)驗(yàn)動物對空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力測試[4]。定位航行實(shí)驗(yàn)中“逃避潛伏期”是評價(jià)動物的學(xué)習(xí)與記憶能力評價(jià)的主要指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前期，采用每天第1次訓(xùn)練的成績作為評價(jià)指標(biāo)以反應(yīng)大鼠對前一天訓(xùn)練結(jié)果的記憶[6]，連續(xù)訓(xùn)練5 d，篩選出50只“逃避潛伏期”無顯著性差異的大鼠進(jìn)行分組。除正常組外的其他各組大鼠，分別給予D-半乳糖120 mg/kg/d，腹腔注射9周，正常組給予等量生理鹽水，同時(shí)每天分別灌胃給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組大鼠當(dāng)歸補(bǔ)血湯2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg，模型組與正常組給予等量生理鹽水。分別于第3周、第6周、第9周注射D-半乳糖24 h后再次進(jìn)行逃避潛伏期測試并記錄。

1.5 腦指數(shù)的測定 大鼠稱重后，斷頭，解剖頭部，取腦，稱取新鮮完整的大鼠腦組織濕重，計(jì)算腦指數(shù)。腦指數(shù)=腦濕重/體重(mg/g)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模前逃避潛伏期情況 造模前，大鼠“逃避潛伏期”在第1～3天無明顯變化(P>0.05)；訓(xùn)練第4天，各組大鼠基本可在90 s內(nèi)尋找到平臺，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；訓(xùn)練第5天各組逃避潛伏期顯著縮短，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上表明各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力無明顯差異，符合本次實(shí)驗(yàn)入選標(biāo)準(zhǔn)及隨機(jī)分組原則。見表1。

表1 大鼠造模前逃避潛伏期結(jié)果

2.2 對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠逃避潛伏期的影響 應(yīng)用D半乳糖造成衰老大鼠模型第3、6、9周結(jié)果顯示，第3周模型組大鼠逃避潛伏期呈上升趨勢，與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常組比較，第6周、第9周模型組大鼠逃避潛伏期顯著增高 (P<0.05)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組均可在一定程度上降低衰老大鼠逃避潛伏期，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第9周當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組逃避潛伏期顯著低于模型組(P<0.05)。這表明腹腔注射D半乳糖6周時(shí)大鼠空間記憶能力顯著下降，已形成衰老大鼠模型，灌胃給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯可在不同程度上改善衰老大鼠空間記憶能力，且呈劑量依賴性，以第9周當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組效果最為顯著。見表2。

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠逃避潛伏期的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠腦指數(shù)的影響 應(yīng)用D半乳糖造成衰老大鼠模型第9周結(jié)果顯示，模型組大鼠體重與腦指數(shù)顯著低于正常組(P<0.05)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組可顯著提高衰老大鼠體重與腦指數(shù)(P<0.05)。表明大鼠應(yīng)用D半乳糖9周可明顯損傷大鼠腦組織，形成衰老大鼠模型，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可在一定程度上對抗此進(jìn)程，尤以高劑量組較為顯著。見表3。

表3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠腦指數(shù)的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

氣能生血，氣盛則血旺，氣虛則血少。血液是精神意識活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)?！鹅`樞·營衛(wèi)生會》指出：“血者，神氣也?！毖?dú)獬溆?，則精力旺，記憶力強(qiáng)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自李皋《內(nèi)外傷辨惑論》，為補(bǔ)氣生血法代表方劑，主治“血虛發(fā)熱證”，但同時(shí)也廣泛用于各類疾病氣虛、血虛或氣血兩虛證的治療?！夺t(yī)方考》稱其“曰補(bǔ)血湯者”，是“有形之血生于無形之氣故也”?，F(xiàn)代研究表明，該方可有效改善患者血液微環(huán)境，提高機(jī)體造血細(xì)胞的造血功能，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及巨核細(xì)胞的生長，防止巨核細(xì)胞凋亡[7]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其具有促骨髓有核細(xì)胞DNA合成、促骨髓粒系及紅系造血祖細(xì)胞增殖、分化的能力[8]、增強(qiáng)免疫功能亦是其功效之一[9]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯亦可通過抑制自由基生成及細(xì)胞凋亡，以保護(hù)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元[10-11]。同時(shí)，補(bǔ)氣中藥具改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用[12]。

近年來，D-半乳糖所致雄性SD大鼠衰老模型因其敏感性較高而被廣為應(yīng)用，且SD 大鼠神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，因此一般首選雄性SD大鼠作為動物來源[13]。此外，D-半乳糖可以造成類似自然衰老實(shí)驗(yàn)鼠齒狀回區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷[14]，且D-半乳糖通過腹腔注射，吸收力較強(qiáng)，操作較為方便，安全性較佳，大鼠存活率高[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)給予SD雄性大鼠連續(xù)9周腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg/d，形成衰老模型，觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對衰老大鼠空間記憶力的影響。結(jié)果表明，造模前各組大鼠每天定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的逃避潛伏期無顯著差異，表明各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力相當(dāng)。造模第3周，模型組大鼠逃避潛伏期呈上升趨勢，但與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第6周與第9周模型組大鼠逃避潛伏期顯著高于正常組 (P<0.05)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組均可在一定程度上降低衰老大鼠逃避潛伏期，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第9周當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組逃避潛伏期顯著低于模型組(P<0.05)，且當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組衰老大鼠體重與腦指數(shù)顯著提高 (P<0.05)。

綜上所述，給藥雄性大鼠腹腔注射D-半乳糖6～9周可形成較為顯著的空間記憶力減退的衰老大鼠模型，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可改善模型大鼠空間記憶能力，以高劑量較為顯著?？傊?dāng)歸補(bǔ)血湯可作為益氣補(bǔ)血、生髓養(yǎng)腦之品，改善因衰老而造成的記憶力減退。