三種分子生物學(xué)方法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的效能分析

馬進(jìn)寶 楊翰 任斐 黨麗云

作者單位：710100 西安市胸科醫(yī)院

耐藥結(jié)核病的發(fā)生給控制結(jié)核病帶來了巨大挑戰(zhàn)，及時、準(zhǔn)確地獲得患者耐藥情況是治療及控制耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[1]。目前，表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)仍是診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性的主要方法。然而，表型藥敏試驗獲取結(jié)果時間較長，如BACTEC MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)，其取得結(jié)果時間平均為18 d[2]。這使得患者無法獲得及時和有效的治療，從而導(dǎo)致其痰菌載量增加，肺損傷加重及傳染性持續(xù)[3]。分子生物學(xué)檢測方法能夠快速檢測MTB耐藥性，如GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測在2 h內(nèi)便能獲得利福平(RFP)耐藥結(jié)果?！督Y(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識》認(rèn)為GeneXpert、基因芯片、實時熒光定量PCR熔解曲線法(簡稱“PCR熔解曲線法”)等技術(shù)檢測MTB耐藥性有較好的敏感度及特異度[4]?！禬S 288—2017 肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)已將分子生物學(xué)檢查陽性作為肺結(jié)核病原學(xué)診斷依據(jù)[5]，然而對于分子生物學(xué)檢查能否作為MTB耐藥性診斷依據(jù)仍存在一定的爭議，且對于何種分子生物學(xué)檢測方法更優(yōu)亦無定論。筆者通過分析GeneXpert、基因芯片、PCR熔解曲線法檢測MTB耐藥性的效能，評價3種方法的臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

1.研究對象：選取2017年1月至2018年1月西安市胸科醫(yī)院有表型藥敏試驗結(jié)果的痰MTB培養(yǎng)陽性的774例肺結(jié)核患者作為研究對象，其中，男521例(67.3%)，女253例(32.7%)；年齡6～96歲，平均年齡(38.5±18.9)歲；初治637例(82.3%)，復(fù)治137例(17.7%)；異煙肼(INH)耐藥210例(27.2%)，RFP耐藥142例(18.4%)，耐多藥133例(17.2%)。774例患者均有一、二線抗結(jié)核藥物表型藥敏試驗結(jié)果，其中357例患者GeneXpert檢測陽性，727例患者基因芯片檢測陽性，201例患者PCR熔解曲線法檢測陽性。

2.液體培養(yǎng)及藥敏試驗：采用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行液體培養(yǎng)，參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[6]操作。取處理好的痰標(biāo)本0.5 ml加入MGIT液體培養(yǎng)管中，放入BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性標(biāo)本，進(jìn)一步用MPB64單克隆抗體(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)進(jìn)行測定，鑒定為MTB菌株進(jìn)行表型藥敏試驗。一線抗結(jié)核藥物INH和RFP耐藥性應(yīng)用BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗檢測，INH藥物濃度為0.1 μg/ml，RFP藥物濃度為1.0 μg/ml；二線抗結(jié)核藥物耐藥性應(yīng)用比例法藥敏試驗檢測，左氧氟沙星(Lfx)藥物濃度為2 μg/ml，莫西沙星(Mfx)藥物濃度為2 μg/ml，阿米卡星(Am)藥物濃度為30 μg/ml，卷曲霉素(Cm)藥物濃度為40 μg/ml。

3.GeneXpert檢測：取1 ml痰標(biāo)本放置在有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當(dāng)于痰標(biāo)本2倍體積的檢測樣品試劑(SR)，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。打開反應(yīng)盒，使用試劑盒內(nèi)提供的專用無菌吸管，取2 ml處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放置到檢測模塊，儀器開始自動化檢測。接種后的痰標(biāo)本消化液按照 GeneXpert(美國 Cepheid 公司)標(biāo)準(zhǔn)化操作手冊步驟進(jìn)行操作[7]。

4.基因芯片檢測：基因芯片檢測系統(tǒng)及配套試劑均由北京博奧生物有限公司生產(chǎn)，將消化液(10 ml 2.94%檸檬酸三鈉、10 ml 4%氫氧化鈉、0.1 g 乙酰半胱氨酸)預(yù)處理好的痰標(biāo)本放入晶芯Extractor 核酸快速提取儀中提取核酸，將提取的核酸放入基因擴增儀中進(jìn)行擴增，基因擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后加入到MTB 耐藥檢測試劑盒的芯片點陣中，然后放入晶芯BioMixer Ⅱ雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)，再將完成雜交的芯片放入晶芯 Slide Washer芯片洗干儀中進(jìn)行洗干，將洗干的芯片載入晶芯LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀中，自動進(jìn)行結(jié)果判讀。

5.PCR熔解曲線法：由廈門致善生物科技股份有限公司研發(fā)。取處理好痰標(biāo)本1 ml加入有螺旋蓋的前處理管中，加入相當(dāng)于痰標(biāo)本2倍體積的處理液，旋緊管口振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，打開反應(yīng)盒，取2 ml處理好的標(biāo)本由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放在檢測模塊，儀器自動檢測，反應(yīng)結(jié)束后在窗口下直接觀察結(jié)果。

6.統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計算各檢測方法檢測效能：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。兩種方法檢測結(jié)果一致性用Kappa值判定，Kappa值≥0.75說明一致性好，Kappa值<0.4說明一致性差，0.75>Kappa值≥0.4說明一致性一般。使用MedCalc 18.2.1軟件分析受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積，曲線下面積差異性分析使用Z檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1. GeneXpert檢測：357例GeneXpert檢測陽性患者中有初治患者264例(74.0%)，復(fù)治患者93例(26.0%)。其中，表型藥敏試驗檢測RFP耐藥91例(25%)，GeneXpert檢測RFP耐藥104例(29%)例。以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測MTB對RFP耐藥性的敏感度為95.6%，特異度為93.6%，陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為83.7%、98.4%，兩種方法有較好的一致性。分別對初、復(fù)治患者進(jìn)行檢測，GeneXpert檢測初治患者對RFP耐藥性的陽性預(yù)測值較低，而檢測復(fù)治患者對RFP耐藥性的陽性預(yù)測值為95.1%，見表1。

2.基因芯片檢測：727例基因芯片檢測陽性患者中有初治患者616例(84.7%)，復(fù)治患者111例(15.3%)；其中，表型藥敏試驗檢出RFP耐藥97例(13.3%)，INH耐藥165例(22.7%)；基因芯片檢出RFP耐藥110例(15.1%)，INH耐藥135例(18.6%)。以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測MTB對RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為92.8%和96.8%；分別檢測初、復(fù)治患者，基因芯片檢測初治患者對RFP耐藥性的陽性預(yù)測值較低(71.9%)；檢測初、復(fù)治患者對RFP耐藥性的陰性預(yù)測值均大于94%。兩種檢測方法檢測MTB對RFP耐藥性有較好的一致性，見表2。以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測MTB對INH耐藥性的敏感度和特異度分別為78.8%和99.1%，陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為96.3%和96.1%，兩種方法檢測MTB對INH耐藥性的一致性較好，見表3。

3. PCR熔解曲線法：201例患者PCR熔解曲線法檢測陽性，以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，PCR熔解曲線法檢測MTB對一線抗結(jié)核藥物、氟喹諾酮類藥物及二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥性的效能見表4。PCR熔解曲線法檢測MTB對RFP及INH耐藥性的陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均較高，與表型藥敏試驗一致性較好；檢測MTB對二線藥物L(fēng)fx和Am耐藥性的效能與表型藥敏試驗一致性較好；但檢測MTB對Mfx、Cm耐藥性的效能與表型藥敏試驗一致性一般。

表1 GeneXpert檢測以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)檢測MTB對利福平耐藥性的效能

表2 基因芯片法以表型藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測MTB對利福平耐藥性的效能

表3 基因芯片法以表型藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測MTB對異煙肼耐藥性的效能

表4 PCR熔解曲線法以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的效能

4. ROC曲線分析：以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，繪制3種分子生物學(xué)檢測方法檢測MTB對RFP耐藥性ROC曲線，GeneXpert法ROC曲線下面積大于基因芯片及PCR熔解曲線法ROC曲線下面積，GeneXpert法ROC曲線下面積為0.95±0.02，基因芯片法和PCR熔解曲線法ROC曲線下面積均為0.93±0.03，三種方法曲線下面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.87，P=0.387)(圖1)。

基因芯片與PCR熔解曲線法ROC曲線完全重合圖1 以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，3種分子生物學(xué)方法檢測MTB對RFP耐藥性的ROC曲線

討 論

本研究結(jié)果顯示，3種分子生物學(xué)方法檢測MTB對RFP耐藥性均比較可靠(Kappa值均大于0.75)，考慮是因為GeneXpert、基因芯片法及PCR熔解曲線法均通過測定MTB的rpoB基因突變檢測RFP耐藥。并且，RFP耐藥MTB的rpoB基因突變率為95%[8]。本次研究中，GeneXpert檢測MTB對RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為95.6%和93.6%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道一致[9-10]，比較ROC曲線下面積發(fā)現(xiàn)GeneXpert的曲線下面積大于其他兩種方法，這可能與GeneXpert是集痰標(biāo)本處理、DNA提取、核酸擴增、MTB特異核酸檢測、RFP耐藥基因rpoB突變檢測于一體的方法有關(guān)[11]。

另外，本次研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert及基因芯片檢測MTB對RFP耐藥性的陽性預(yù)測值在復(fù)治患者中高于初治患者，提示這兩種方法在復(fù)治患者中檢出RFP耐藥更可靠，考慮是因為在復(fù)治患者中RFP耐藥發(fā)生率較初治患者高有關(guān)[12]。根據(jù)WHO估計，中國RFP耐藥在初、復(fù)治患者中發(fā)生率分別為12%、69%[13],復(fù)治患者中RFP耐藥率是初治患者中的5倍。復(fù)治患者中GeneXpert及基因芯片檢測MTB對RFP耐藥性陽性預(yù)測值為95.1%和92.5%，與表型藥敏試驗一致性較好，結(jié)果支持《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識》[4]中提出當(dāng)分子生物學(xué)方法測出RFP耐藥時當(dāng)患者為耐藥高危人群時，應(yīng)同時進(jìn)行傳統(tǒng)的藥敏試驗，并采用二線抗結(jié)核藥物治療的觀點。

氟喹諾酮類藥物在耐藥結(jié)核病治療中至關(guān)重要，世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年及2018年耐藥結(jié)核病治療指南中氟喹諾酮類藥物均在A組藥物當(dāng)中[3，14]。由于近10余年來，氟喹諾酮類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，尤其是在我國呼吸和結(jié)核病領(lǐng)域的濫用，其耐藥率呈逐年上升趨勢[15]。因此，在制定耐藥患者藥物治療方案時獲得氟喹諾酮類藥物耐藥情況尤為重要，WHO也建議對于RFP耐藥結(jié)核病患者使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行氟喹諾酮類藥物藥敏試驗[16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，PCR熔解曲線法檢測MTB對Lfx及Am耐藥性敏感度為87.1%和75.0%，特異度為98.8%和99.5%，且與表型藥敏試驗有較好的一致性，與Pang等[17]報道一致。因此，筆者認(rèn)為在獲得表型藥敏試驗結(jié)果之前制定耐藥結(jié)核病患者藥物治療方案時，可根據(jù)PCR熔解曲線法檢測結(jié)果選擇Lfx和Am。

本次研究顯示，以表型藥敏試驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測INH耐藥性敏感度和特異度分別為78.8%和99.1%，與林明冠等[18]報道一致，但陽性及陰性預(yù)測值與該文獻(xiàn)報道結(jié)果有異，可能與所選研究對象INH耐藥率不同及對照方法不同有關(guān)。另外，筆者發(fā)現(xiàn)基因芯片法檢測INH耐藥性的陰性預(yù)測值在復(fù)治患者中低于初治患者，與Zhu等[19]研究結(jié)果基本一致，其陰性預(yù)測值均小于90%，說明在復(fù)治患者中基因芯片法檢出INH敏感時，可信度較差。

PCR熔解曲線法檢測MTB對INH耐藥性突變基因包括KatG、inhA、ahPc[20]。本次研究顯示，PCR熔解曲線法檢測MTB對INH耐藥性的敏感度和特異度分別為82.4%和95.3%，與Pang等[17]和王曉艷等[21]報道一致，且敏感度均高于本次研究基因芯片法，亦高于林明冠等[18]和Zhang等[22]報道的基因芯片法檢測敏感度。這可能與PCR熔解曲線法增加了ahPc位點檢測有關(guān)，說明隨著耐藥基因檢測位點的完善，分子生物學(xué)方法檢測效能會增加。

綜上所述，本次研究分析了3種分子生物學(xué)方法檢測MTB耐藥性的效能，結(jié)果顯示3種方法均有較高的敏感度和特異度；分析了在初、復(fù)治患者中GeneXpert及基因芯片法檢測效能差異，結(jié)果顯示在不同類型患者中其陽性及陰性預(yù)測值不同，提示在臨床工作中除了考慮檢測方法敏感度與特異度外，需結(jié)合患者情況具體分析其臨床意義。本次研究不足為INH和RFP表型藥敏試驗應(yīng)用BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗，雖然該方法與比例法藥敏試驗有較好的一致性[11]，但仍可能導(dǎo)致結(jié)果差異，可能影響對3種分子生物學(xué)方法檢測效能的判斷。另外，本次研究為回顧性分析，且研究對象例數(shù)較多，可能導(dǎo)致收集的患者信息(包括年齡、初復(fù)治、耐藥結(jié)果等)存在偏倚。臨床應(yīng)用中比較檢測方法優(yōu)劣時應(yīng)同時考慮經(jīng)濟因素，但本研究未對該方面問題進(jìn)行分析。