高效液相法測定酮洛芬凝膠中的有關物質

王曉飄 肖學成

[摘要]目的 通過高效液相色譜建立酮洛芬凝膠中有關物質的檢測方法。方法 采用色譜柱ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.15%三氟乙酸乙腈溶液為流動相A，以0.15%三氟乙酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，檢測波長為254 nm， 流速為1.3 ml/min;柱溫為30℃。結果 在所建立的色譜條件下，酮洛芬與各雜質分離度良好，酮洛芬凝膠溶液在12 h內穩(wěn)定，各雜質及主峰的RSD均<2%。結論 本法專屬性好，可以有效分離各主成分及有關物質，可以準確測定酮洛芬凝膠中酮洛芬的有關物質。

[關鍵詞]酮洛芬凝膠;酮洛芬;高效液相色譜法;有關物質

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（b）-0008-04

酮洛芬的化學名為3-苯甲?；?α-甲基苯乙酸，是一種優(yōu)良的2-芳基丙酸類非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥[1]。其作用機制主要是通過抑制體內環(huán)氧合酶（COXs）、脂氧化酶（LOXs）的生物活性，從而抑制致炎物質前列腺素（PGs）、白三烯（LTs） 的合成，酮洛芬還具有對抗緩激肽釋放、清除羥自由基以及穩(wěn)定溶酶體膜活性，產(chǎn)生良好的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用[2]。臨床研究表明[3]，酮洛芬是治療類風濕性關節(jié)炎疾病的首選藥物[4]，國外還用于治療牙痛、術后疼痛、癌性疼痛和紅斑狼瘡、支氣管炎等疾病[5]，對于軟組織受傷的治療效果也非常好[6]。

酮洛芬凝膠是酮洛芬的新型載體-傳遞體（transfersome）凝膠制劑，主要用于骨性關節(jié)炎、肩關節(jié)周圍炎、肌腱炎等疾病的鎮(zhèn)痛治療[7]。傳遞體載體能用于靶向用藥部位之下的肌肉和關節(jié)，因為它們不會被局部的皮下微循環(huán)所清除[8]，可提高局部藥物濃度，增強藥效[9]。近年來對酮洛芬凝膠進行研究，為抑制軟組織損傷相關性疼痛提供了一種有前途的方法[10]。

1材料與方法

1.1儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安）;AUW 220D電子分析天平（日本島津）;ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）;CSH-1000 GSD-1型綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱（重慶創(chuàng)測科技有限公司）。

1.2藥物與試劑

酮洛芬凝膠（武漢諾安藥業(yè)有限公司，批號：20170401、 20170402、20170403）;市售酮洛芬凝膠（A.Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite S.r.l.，批號：269、270;商品名：法斯通凝膠）;酮洛芬對照品（由中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100337-201104）;酮洛芬雜質A對照品（由歐洲藥典委員會提供，批號：00IFG7、00H5N6）;酮洛芬雜質B對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-14712-1407）;酮洛芬雜質C對照品（由歐洲藥典委員會提供，批號：0022rJ、0022tD）;酮洛芬雜質D對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-14714-1505）;酮洛芬雜質E對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-14715-1504）;酮洛芬雜質F對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-14716-1309）;酮洛芬乙酯對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-147111-1507）。

乙腈（色譜純，Merck）;三氟乙酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）;氯化鈉（臺山市新寧制藥有限公司）。

2方法與結果

2.1色譜條件

采用ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以0.15%三氟乙酸-乙腈溶液為流動相A，以0.15%三氟乙酸溶液為流動相B，檢測波長設為254 nm，柱溫設為30℃，流速為1.3 ml/min，進樣量20 μl，梯度洗脫程序見表1。

2.2溶液的配置

2.2.1供試品溶液? 取酮洛芬凝膠約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加0.15%三氟乙酸-乙腈溶液-0.15%三氟乙酸溶液（20∶80）（以下稱稀釋劑）20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液（1 mg/ml）。

2.2.2原料供試品溶液? 取酮洛芬原料藥20 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3空白輔料溶液? 取不含酮洛芬的空白凝膠約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.2.4對照品溶液? 精密量取“2.2.1”項下的供試品溶液適量，加稀釋劑定量稀釋成濃度約為2 μg/ml的對照品溶液。

2.2.5系統(tǒng)適用性溶液? 取酮洛芬原料約50 mg，置50 ml量瓶中，再分別精密量取酮洛芬雜質A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯對照品儲備液各1 ml置同一50 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.6雜質對照品溶液? 取酮洛芬雜質A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯對照品適量，精密稱量，加稀釋劑溶解并稀釋成濃度約為100 μg/ml的雜質對照品儲備液。精密量取各雜質對照品儲備液1～50 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得濃度約為2 μg/ml各雜質對照品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2.5”項下的系統(tǒng)適用性溶液20 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖1），結果表明各雜質峰與主峰分離度良好，相互之間不會形成干擾，保留時間及分離度見表2。

2.4專屬性試驗

2.4.1制劑光破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置4500Lx±500Lx的強光下照射26 h，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.2制劑酸破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，振搖，使氯化鈉溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，再加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.3制劑堿破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，振搖，使氯化鈉溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L鹽酸溶液2 ml中和，再加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.4制劑熱破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置100℃水浴中破壞4 h后，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.5氧化破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加30%的H2O2 2 ml，搖勻，避光放置20 h后，于80℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

按上述擬定的色譜條件，分別取制劑的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進樣，記錄色譜圖。結果表明，酮洛芬凝膠的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進樣，各降解產(chǎn)物峰與主峰之間的分離度均符合規(guī)定。

2.5 精密度試驗

取“2.2.5”項下的系統(tǒng)適用性溶液，在上述擬定的色譜條件下連續(xù)進樣6針，結果表明，各雜質及主峰的RSD均<2%，符合藥典要求，詳見表3。

2.6穩(wěn)定性試驗

取本品凝膠（批號2017401）按“2.2.1”項下的測定方法，配置供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進樣，記錄色譜圖，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結果顯示，凝膠中雜質C峰面積的RSD=0.96%，保留時間的RSD=0.18%，表明樣品溶液在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定。

2.7定量限與檢測限考察

取雜質A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯對照品溶液，分別進樣進行測定，當信噪比（S/N）約為10時，雜質A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯的定量限分別為0.6、 0.6、1.0、1.6、0.8、1.6、0.8 ng。當信噪比（S/N）≥3時，雜質A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯的檢測限分別為0.2、0.2、0.3、0.5、0.2、0.5、0.3 ng。

2.8樣品測定

取批號為20170401、20170402、20170403三批樣品及市售樣品（269），照上述確定方法檢查其有關物質，結果見表5。三批樣品及市售樣品均未檢出雜質A、雜質C、雜質F，各樣品中均檢出雜質B、雜質D、雜質E及酮洛芬乙酯。

3討論

3.1檢測波長的選擇

酮洛芬原料EP 8.0版和USP 38版中有關物質檢查方法為HPLC法，檢測波長為233 nm。酮洛芬凝膠進口藥品注冊標準中有關物質的檢測方法為HPLC法[11]，檢測波長為255 nm。取上述“2.2.5”項下的系統(tǒng)適用性溶液各20 μl，分別在255、233 nm的波長條件下進樣，確定各雜質與主峰在各波長條件下的檢出情況。檢測結果表明，254 nm波長條件下雜質的檢出效果明顯優(yōu)于233 nm，雜質B、D、E、F和酮洛芬乙酯的最大吸收波長與酮洛芬凝膠進口藥品注冊標準中有關物質檢測波長一致。故本實驗將255 nm作為酮洛芬凝膠有關物質檢測的波長，優(yōu)化酮洛芬凝膠有關物質的檢測條件[12]。

3.2酮洛芬有關物質的檢測方法制定

文獻中酮洛芬凝膠有關物質的檢查方法，和EP 8.0版質量標準中有關物質檢測的色譜條件一致[13]。有機相均為乙腈，水系分別為0.15%三氟乙酸溶液和磷酸鹽緩沖液，水系中鹽的成分均較少，作用是調整基線和峰形。如果將文獻中梯度洗脫程序中有機相的比例調整至和EP 8.0版一致，即將第二步梯度（75 min）的有機相比例由31%增加到45%，將水系比例由69%降低至55%，同時對第三步梯度進行修改，即保持換相后的第二步梯度的濃度，以保證酮洛芬乙酯可有效洗脫。按此條件，可以達到較好的分離效果，且所得圖譜各峰峰形比較好，對酮洛芬凝膠有關物質[14]的檢測的色譜條件進行了優(yōu)化。

3.3小結

《日本藥典》17版[15]、《美國藥典》40版[16]、《歐洲藥典》8.0版本[17]中均采用HPLC法對酮洛芬進行有關物質的分析，但僅EP 8.0版[18]中給出了6種已知雜質的保留時間。對于酮洛芬凝膠制劑的研究則更少[19]，僅BP 13版中收載了有關物質檢測標準，但檢測方法為TLC法，且僅檢測了酮洛芬乙酯雜質[20]。本實驗對酮洛芬凝膠中雜質的檢測進行了優(yōu)化：①將USP 38版和EP 8.0版中規(guī)定的C18柱修改成了苯基柱;②將USP 38版和EP 8.0版中規(guī)定的流動相體系：磷酸鹽緩沖液-水-乙腈（2∶55∶43）等度洗脫修改了以0.15%三氟乙酸溶液和0.15%三氟乙酸乙腈溶液按一定比例進行梯度洗脫的方式。本實驗建立的方法檢查酮洛芬凝膠的有關物質，也為主成分的鑒別及含量測定提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2018-10-18? 本文編輯：許俊琴）