微生物法檢測實(shí)驗(yàn)動物血清中的抗生素殘留

鐘克焱，甘楊子

（海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199）

實(shí)驗(yàn)動物在飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)過程中常使用抗生素，這不可避免地會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物血液中存在抗生素及其代謝產(chǎn)物會殘留一段時間，這可能會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)[1]。有抗生素殘留的動物本身并不是合格的實(shí)驗(yàn)動物，抗生素殘留可能會干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，對實(shí)驗(yàn)動物血清中的抗生素殘留檢測，主要采用液相色譜、質(zhì)譜分析等，但是這些分析方法更適合進(jìn)行量化分析，同時價格也相對更高。微生物法檢驗(yàn)是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的測定方法，其利用抗生素對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用，與陰性對照進(jìn)行對比，反映待測樣本中是否存在抗生素殘留。微生物檢測法包括括紙片法、TTC法、管碟法、試劑盒檢測法，這些方法操作簡單，可供選擇的是檢測試劑材料豐富，可讀性強(qiáng)，許多甚至通過肉眼便可以觀看微生物的孢子萌發(fā)是否受到抑制，從而判斷是否存在抗生素殘留。本文嘗試采用實(shí)驗(yàn)動物血清中的抗生素殘留，為抗生素殘留檢測方法建立提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、材料

選擇實(shí)驗(yàn)室SD大鼠，數(shù)量不限，麻醉后取股動脈血，-4 ℃保存，獲得血液100份，每只1 mL。嗜熱脂肪芽孢桿菌，青霉素等抗生素，甲苯胺藍(lán)，MRS肉湯培養(yǎng)基等。電子天平，電熱恒溫水浴鍋，酸度計，生化培養(yǎng)箱，生物學(xué)顯微鏡，不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.2 方法

以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為檢測菌種，根據(jù)藥典中有關(guān)于抗生素殘留微生物檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)，參照管碟法檢測不同抗生素的檢測限，以新生大鼠血清作為陰性對照。以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測測定實(shí)驗(yàn)動物中的獸用抗生素的有效含量?？股貥?biāo)準(zhǔn)儲備液及工作溶液的稀釋劑的選擇參考國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中所用稀釋劑。采用嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法制備含有不同抗生素含量的血液樣品，以檢出陽性的最低限度抗生素濃度作為嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對該種抗生素的檢出限。分別采用LPLC-MS/MS、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測隨機(jī)獲得的415份實(shí)驗(yàn)動物血液，以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，評價嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測抗生素殘留效用。

1.3 觀察指標(biāo)

LPLC-MS/MS測定的商品抗生素含量、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法測定抗生素的檢出限度。實(shí)測過程LPLC-MS/MS法。

2 結(jié)果

2.1 檢出限比較

LPLC-MS/MS測定的商品抗生素含量、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法測定抗生素的檢出限度如下，見表1。

2.2 實(shí)測

以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，測定415份實(shí)驗(yàn)動物血液樣本，其中陽性72例、陰性343例，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法的靈敏度84.7%（61/72）、特異度99.1%（340/343）、陽性預(yù)測值95.3%（61/64）、陰性預(yù)測值96.9%（340/351）、符合率96.6%（401/415）。

表1 兩種方法測定實(shí)驗(yàn)動物血液中抗生素的檢出限度

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物血清抗生素殘留的檢測是實(shí)驗(yàn)室動物管理的重要組成部分，可以反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物供應(yīng)機(jī)構(gòu)的飼養(yǎng)情況、質(zhì)控水平[2-3]。微生物法是抗生素殘留檢測重要方法，但是精度常無法讓人滿意，需要明確檢測限度，建立檢測體系。本文選擇指南推薦的嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法進(jìn)行研究，以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，嘗試建立嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測體系。

研究顯示，微生物法檢測實(shí)驗(yàn)動物血清中的抗生素殘留的效用尚可，盡管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以滿足部分抗生素檢測的需求，可以作為快速檢測法。以金標(biāo)準(zhǔn)作為檢測對照，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法的靈敏度84.7%、特異度99.1%、陽性預(yù)測值95.3%、陰性預(yù)測值96.9%、符合率96.6%，反映了嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法可以快速檢測抗生素殘留，且效用較好，從檢出效率來看，理想狀態(tài)下與LPLCMS/MS法接近。從檢出限度大小變化來看，該方法與LPLC-MS/MS法檢測限度有相關(guān)性，即抑菌法檢測限度越高，一般LPLC-MS/MS法限度也越高，但嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對頭孢噻呋鈉、芐星青霉親、紅霉素的檢測限度較低，這與檢測菌的耐藥性、受抑制抗生素作用的特性有關(guān)[4]。

但需注意的是，研究中，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對各類抗生素殘留檢測限度在3～70ng/g之間，存在較大的差異。本次研究中嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對頭孢氨芐等抗生素的檢出限度較高，這反映了微生物抑制法存在固有的缺陷，檢測精度達(dá)不到國家的要求。因此，在選擇檢測菌時，需盡量選擇那些耐藥性較低、對抗生素普遍敏感的微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌。也可以嘗試聯(lián)合其他微生物抑菌法，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌檢出限度較高的頭孢噻呋鈉、芐星青霉親、紅霉素等抗生素敏感的指示菌，建立實(shí)驗(yàn)動物抗生素殘留的檢測體系，以覆蓋絕大多數(shù)的獸用抗生素。當(dāng)然，不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物的來源不同，對質(zhì)量要求也不同，建立抗生素殘留檢測體系需要根據(jù)自身的實(shí)際需要[4-5]。

本次研究也存在許多不足之處，實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果是理想條件下單一抗生素殘留檢測。在實(shí)踐過程中，實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)可能會存在多種抗生素，這些抗生素混雜會干擾檢測結(jié)果，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對于多種抗生素殘留檢測效果并不理想[6-7]。

4 小結(jié)

微生物法檢測實(shí)驗(yàn)動物血清中的抗生素殘留的效用尚可，盡管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以滿足檢測的需求，可以作為抗生素含量快速檢測。