不同來源多種蟲草核苷類物質(zhì)檢測分析比較

張鑫喆，徐方旭，柳葉飛，王升厚*

（1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué) 實驗教學(xué)中心，遼寧沈陽 110034）

冬蟲夏草、蛹蟲草和蟬花蟲草為我國蟲草領(lǐng)域研究和應(yīng)用最廣泛的三個品系，三者在生物活性成分及生物學(xué)功能等方面具有很多相似之處[1]。其中核苷類物質(zhì)作為蟲草的主要活性成分之一，具有廣泛的生理功能，至今已從蟲草及發(fā)酵菌絲中分離鑒定到11種核苷類化合物，包括蟲草素、腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶、尿苷、鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷和胸腺嘧啶等[2]。多年來，圍繞蟲草素、腺苷、蟲草酸等活性物質(zhì)的檢測與研究已有很多報道，但隨著噴司他丁[3]等最新研究成果的出現(xiàn)，表明人們對蟲草中存在的潛在重要天然化合物的挖掘和認(rèn)識尚處于起步階段。

功能性蛹蟲草概念是沈陽師范大學(xué)蛹蟲草研究團(tuán)隊于2008年提出的，它是以成分指標(biāo)作為蛹蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評價體系，2016年《一種功能性蛹蟲草的培育方法》發(fā)明專利獲得授權(quán)。由于功能性蛹蟲草人工培育中需要采用特殊的菌種，獨特的培養(yǎng)基配方，以及仿野生的栽培條件，因此所培育的蛹蟲草子實體內(nèi)蟲草素含量可以達(dá)到很高的水平[4]。本研究旨在通過相同的檢測平臺對目前三大商業(yè)性蟲草的核苷類物質(zhì)進(jìn)行同步檢測與分析，以期獲得基礎(chǔ)的成分?jǐn)?shù)據(jù)，為后續(xù)比較研究和應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料由沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所提供，樣品名稱及代號見表1。

表1 樣品名稱及代號

1.2 試劑與儀器

試劑：蟲草素及腺苷等標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司（產(chǎn)品純度均大于99%），甲醇為色譜純，試驗用水為自制雙蒸水。

儀器：安捷倫LC1200液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司

1.3 測定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，分別用去離子水定容至50 mL，配成濃度為0.1 mg/mL的母液。分別量取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、7 mL標(biāo)準(zhǔn)母液定容至50 mL，配制成濃度為0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.014 mg/mL的胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 核苷類物質(zhì)提取

將11種樣品烘干至恒重，用研磨機(jī)粉碎，過80目篩。準(zhǔn)確稱取待測樣品粉末0.500 g，置于廣口瓶中，加入蒸餾水80 mL，于85℃水浴環(huán)境下提取3.5 h。冷卻至室溫，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液作為檢測樣品溶液[5]。

1.3.3 高效液相色譜儀測定核苷類物質(zhì)含量

測量條件：進(jìn)樣量20 μL、流速0.8 mL/min、波長260 nm、甲醇（有機(jī)相）∶超純水（流動相）=85∶15。

1.3.4 計算核苷類物質(zhì)含量

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中胞苷含量分析

樣品中胞苷含量的實驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，11組試驗樣品中，不同樣品的胞苷含量各不相同，其中以功能性蛹蟲草蛹體含量最高，含量為9 445.87 mg/kg，功能性蛹蟲草子實體中胞苷含量最低為144.48 mg/kg。其中功能性蛹蟲草和活蛹蟲草的蟲體體中胞苷含量均顯著高于其子實體（P＜0.05）。功能性蛹蟲草子實體、小麥清水草子實體、富硒大米草子實體、活蛹蟲草子實體中胞苷含量均存在顯著差異（P＜0.05）。功能性蛹蟲草蛹體、活蛹蟲草蛹體之間也存在顯著差異（P＜0.05），野生蟬花蟲草和蟬花蟲草粉之間胞苷含量差異顯著（P＜0.05），而野生蛹蟲草和活蛹蟲草的子實體和蟲體之間也存在極其顯著的差異（P＜0.01）。

圖1 樣品中胞苷含量

2.2 樣品中尿苷含量分析

樣品中尿苷含量分析的實驗結(jié)果見圖2。由圖2可知，11組試驗樣品中，不同樣品的尿苷含量差異顯著，其中以野生蛹蟲草含量最高，含量為2049 mg/kg，蟬花蟲草粉含量最低為365.03 mg/kg。功能性蛹蟲草子實體中尿苷含量顯著高于功能性蛹蟲草蟲體，而活蛹蟲草蟲體中的尿苷卻高于活蛹蟲草子實體（P＜0.05）。功能性蛹蟲草子實體、小麥清水草子實體、富硒大米草子實體、活蛹蟲草子實體中尿苷含量均存在顯著差異（P＜0.05）。功能性蛹蟲草蟲體、活蛹蟲草蟲體之間也存在顯著差異（P＜0.05），野生蟬花蟲草和蟬花蟲草粉之間尿苷含量差異顯著。（P＜0.05）而野生蛹蟲草和活蛹蟲草的子實體和蟲體之間也存在顯著的差異（P＜0.05）。

2.3 樣品中肌苷含量分析

樣品中肌苷含量分析的實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，11組試驗樣品中，冬蟲夏草的肌苷含量最高，為797.57 mg/kg，功能性蛹蟲草蟲體、活蛹蟲草子實體、和富硒大米草中并不含有肌苷。功能性蛹蟲草子實體、小麥清水草子實體尿苷含量均存在顯著差異（P＜0.05）。野生蟬花蟲草和蟬花蟲草粉之間肌苷含量差異顯著（P＜0.05）。而野生蛹蟲草和活蛹蟲草的蟲體之間也存在顯著的差異（P＜0.05）。

圖2 樣品中尿苷含量

圖3 樣品中肌苷含量

2.4 樣品中鳥苷含量分析

樣品中鳥苷含量分析的實驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，11組試驗樣品中的鳥苷含量不同，其中以功能性蛹蟲草蟲體最高，含量為1 828.88 mg/kg，小麥清水子實體中未檢測到鳥苷。功能性蛹蟲草蟲體中尿苷含量顯著高于功能性蛹蟲草子實體，而活蛹蟲草子實體中的尿苷卻顯著高于活蛹蟲草蟲體（P＜0.05）。功能性蛹蟲草子實體、富硒大米草子實體、活蛹蟲草子實體中尿苷含量均存在顯著差異（P＜0.05）。功能性蛹蟲草蛹體、活蛹蟲草蟲體之間也存在顯著差異（P＜0.05），野生蟬花蟲草和蟬花蟲草粉之間鳥苷含量差異顯著（P＜0.05）。而野生蛹蟲草和活蛹蟲草的子實體和蟲體之間也存在顯著的差異（P＜0.05）。冬蟲夏草和活蛹蟲草子實體中的鳥苷含量不存在顯著差異（P＞0.05）。

2.5 樣品中胸苷含量分析

樣品中胸苷含量分析的實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，對于檢測的11種樣品，只有功能性蛹蟲草蟲體、冬蟲夏草和野生蟬花蟲草中含有胸苷，且三者差異極其顯著（P＜0.01）。

2.6 樣品中腺苷含量分析

樣品中腺苷含量分析的實驗結(jié)果見圖6。由圖6可知，11組試驗樣品中，腺苷含量各不相同，其中以功能性蛹蟲草蟲體中含量最高，其含量為2 178.05 mg/kg。其次是功能性蛹蟲草米基，其含量為1 546.18 mg/kg。活蛹蟲草蛹體中并未檢測到腺苷。功能性蛹蟲草蟲體中腺苷含量顯著高于其子實體（P＜0.05）。功能性蛹蟲草子實體、小麥清水草子實體、富硒大米草子實體、活蛹蟲草子實體中腺苷含量均存在顯著差異（P＜0.05）。功能性蛹蟲草子實體和野生蛹蟲草之間不存在顯著差異（P＞0.05），野生蟬花蟲草和蟬花蟲草粉之間腺苷含量差異顯著（P＜0.05）。

圖4 樣品中鳥苷含量

圖5 樣品中胸苷含量

圖6 樣品中腺苷含量

2.7 樣品中蟲草素含量分析

樣品中蟲草素含量的實驗結(jié)果見圖7。由圖7可知，11組試驗樣品中以功能性蛹蟲草米基中蟲草素含量最高，其含量為17 367.91 mg/kg其次是功能性蛹蟲草蟲體，其含量為15 904.70 mg/kg，功能性蛹蟲草子實體中蟲草素含量高達(dá)10 458.25 mg/kg，蟬花蟲草粉中并未檢測出蟲草素。小麥清水子實體與活蛹蟲草子實體，活蛹蟲草蟲體與冬蟲夏草之間野生蛹蟲草與野生蟬花蟲草之間蟲草素含量不存在顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論

核苷類成分作為蟲草真菌的主要生物活性物質(zhì)，具有多種功效，臨床上已將其應(yīng)用在多種疾病的治療上[6]。在對冬蟲夏草、蟬花蟲草，功能性蛹蟲草等11個樣品的檢測結(jié)果顯示：11個樣品中均含有鳥苷和肌苷，其中只有冬蟲夏草、野生蟬花蟲草、功能性蛹蟲草蟲體當(dāng)中含有胸苷。蟲草素、腺苷、胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷含量最多的樣品分別為功能性蛹蟲草米基、功能性蛹蟲草蟲體、功能性蛹蟲草蟲體、野生蛹蟲草，野生蟬花蟲草、功能性蛹蟲草蟲體、功能性蛹蟲草蟲體，其中7種核苷總含量最高的是功能性蛹蟲草蟲體。筆者認(rèn)為，蟲體中含有豐富的營養(yǎng)成分，會有助于核苷類物質(zhì)的形成，因為功能性蛹蟲草中既添加了小麥培養(yǎng)基與柞蠶蛹，又添加了其他的營養(yǎng)成分，進(jìn)一步刺激了核苷類物質(zhì)的形成。功能性蛹蟲草的米基中核苷類物質(zhì)種類也很豐富，認(rèn)為是由于功能性蛹蟲草在生長的過程中代謝出的核苷類物質(zhì)積累在米基中造成的。本研究對不同的蟲草以及蛹蟲草的不同部位進(jìn)行了核苷類檢測，得到了一些初步結(jié)果，為蟲草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

圖7 樣品中蟲草素含量