兩相厭氧工藝快速啟動運(yùn)行及其群落結(jié)構(gòu)特征研究

馬 蕊, 郭昌梓, 強(qiáng)雅潔, 馬宏瑞

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

厭氧生物處理技術(shù)即在厭氧環(huán)境中，一系列協(xié)同合作的微生物將廢水中復(fù)雜有機(jī)物最終轉(zhuǎn)化為甲烷、CO2、氫氣以及合成為微生物細(xì)胞的過程[1].因其運(yùn)行能耗低，處理負(fù)荷高，剩余污泥少以及可回收沼氣、氫氣等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于高濃度有機(jī)工業(yè)廢水處理中，并取得很好的處理效果[2].但在實(shí)際工業(yè)廢水中，存在大量的硫酸鹽和硫化物，難降解有機(jī)物等毒性物質(zhì)對產(chǎn)甲烷菌的抑制明顯甚至滅活，使厭氧消化系統(tǒng)崩潰.通過兩相分離技術(shù)，分別創(chuàng)造有利于產(chǎn)酸菌與產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)環(huán)境，將有毒或抑制性物質(zhì)在第一相中得到大量去除或轉(zhuǎn)化，可有效提高系統(tǒng)的處理效果，保證系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行，使厭氧技術(shù)得到更高效的應(yīng)用[3].

對于兩相厭氧生物反應(yīng)而言，產(chǎn)酸相的運(yùn)行效果直接影響著整個(gè)工藝系統(tǒng)的處理能力.如何快速啟動產(chǎn)酸相，并使其穩(wěn)定運(yùn)行，對于提高厭氧反應(yīng)效率和水解酸化的正確實(shí)施及廣泛應(yīng)用有著重要意義.

本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)攪拌反應(yīng)器(CSTR)考察兩相厭氧系統(tǒng)的物質(zhì)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)特征，研究內(nèi)容主要包括反應(yīng)器內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)組分變化、pH、ORP及酸化度.同時(shí)采用掃描電鏡及16S rDNA考察污泥形態(tài)和群落結(jié)構(gòu)特征，為兩相厭氧反應(yīng)的快速啟動及提高厭氧消化效率提供理論依據(jù)和運(yùn)行方法，使其更好地在工程實(shí)際中應(yīng)用和推廣.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

圖1為實(shí)驗(yàn)裝置圖，采用連續(xù)攪拌反應(yīng)器(CSTR)，使反應(yīng)器內(nèi)部流態(tài)趨于完全均勻混合，由有機(jī)玻璃制成，采用pH計(jì)及ORP儀實(shí)時(shí)監(jiān)測，配制有進(jìn)水管、出水管和排氣管，總?cè)莘e為6 L，有效容積為5 L.裝置采用套管及水封，保證電機(jī)攪拌槳與反應(yīng)器連接處完全密封，反應(yīng)進(jìn)、出水采用N2作為交換氣體的緩沖袋，保證反應(yīng)器內(nèi)厭氧環(huán)境以及壓強(qiáng)平衡.采用水浴槽自動控溫系統(tǒng)加熱，保持反應(yīng)器內(nèi)部溫度為35±1 ℃.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)用水及污泥

本實(shí)驗(yàn)采用模擬廢水，產(chǎn)酸相投加葡萄糖、N及P營養(yǎng)物，COD∶N∶P=200∶5∶1，按配比添加Ni、Mn、Co等微生物生長所需微量元素.進(jìn)水基質(zhì)中，添加NaHCO3及NaOH以保證適宜的堿度及pH[4].在運(yùn)行初始前四天，加入2 mmol/L鉬酸鈉，以加快實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酸相中產(chǎn)甲烷菌的抑制，其出水直接排放，之后停止投加鉬酸鈉，再運(yùn)行三天，出水仍直接排放，以此避免產(chǎn)酸相出水中殘余的抑制劑對產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生毒害作用[3].在此期間，產(chǎn)甲烷相碳源為乙酸鈉，進(jìn)水COD為3 000 mg/L，以使接種污泥適應(yīng)環(huán)境.一周后，將產(chǎn)酸相出水通過調(diào)節(jié)池添加NaHCO3及NaOH,以調(diào)節(jié)進(jìn)水pH為7.2±0.2，為產(chǎn)甲烷相進(jìn)水.

接種污泥取自陜西省西安市漢斯啤酒廠厭氧罐，呈灰黑色，污泥較濃稠，大顆粒雜質(zhì)，沉渣較多，沉降比在90%左右，MLVSS/MLSS=51.07 g/L/64.35 g/L=0.79.接種污泥過0.25 mm網(wǎng)篩，以去除大顆粒有機(jī)物、殘?jiān)?、纖維及雜質(zhì).確保反應(yīng)器氣密性良好后進(jìn)行厭氧污泥接種，接種量為2.5 L， MLVSS/MLSS=5.424 g/L/10.8 g/L=0.5.

1.3 分析方法

分析項(xiàng)目包括水質(zhì)指標(biāo)，如COD、MLSS、pH、ORP、酸化度、VFA總量及組分分析等；氣體指標(biāo)，如產(chǎn)氣量及氣體組分分析；污泥指標(biāo)，如污泥形態(tài)及微生物群落結(jié)構(gòu)分析.以3 000 rpm離心10 min，取上清液測定各指標(biāo).所有測定指標(biāo)均采用平行樣測定3次，取平均值.pH值采用pHS-3C型測定；ORP采用ORP檢測儀測定；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)經(jīng)預(yù)處理后采用滴定分析法及氣相色譜法(福立 FL9790Plus)(FID檢測器，進(jìn)樣口195 ℃，柱箱程序升溫，90 ℃ 2 min，10 ℃/min升溫到140 ℃，40 ℃/min升溫到200 ℃保持2 min ,柱流量2，分流比5∶1，載氣N2)；酸化率(AR，%)=VFAeff/CODinf×100；酸化度(AD,%)=(r·(VFAeff-VFAinf))/CODinf×100,r為VFA的COD當(dāng)量系數(shù)，r乙酸=1.066.

產(chǎn)氣量用50 mL史式發(fā)酵管計(jì)量；氣體組分采用安捷倫氣相色譜儀(Agilent 6890N)測定，(TCD檢測器，恒溫160 ℃，TDX-01填充柱2 mX0.3 mm，100 ℃，載氣Ar,尾吹N2).

污泥形態(tài)及微生物群落結(jié)構(gòu)分析：將泥樣進(jìn)行脫水干燥預(yù)處理后噴金，進(jìn)行SEM(FEI Q45)觀察；16S rDNA測定前將污泥儲存在-80 ℃，由浙江杭州LC-Bio技術(shù)有限公司測序.

1.4 運(yùn)行參數(shù)控制

實(shí)驗(yàn)采取低負(fù)荷進(jìn)水方式啟動，采取先增加進(jìn)水COD濃度，后縮短水力停留時(shí)間的方式，從而不斷提高進(jìn)水負(fù)荷.依據(jù)污泥生長狀況及廢水處理效果.本研究中啟動階段COD進(jìn)水濃度控制在3 000 mg/L，每天排水2. 5 L，運(yùn)行10 d后，進(jìn)水濃度提高到5 000 mg/L，運(yùn)行15 d，進(jìn)水COD濃度進(jìn)一步提高到8 000 mg/L，之后改變水力停留時(shí)間(HRT)為6 h，每天運(yùn)行12 h，負(fù)荷提高到10 kg/(m3·d).反應(yīng)過程中，為避免反應(yīng)器處于“過酸狀態(tài)”，超過菌體耐受極限，抑制產(chǎn)酸過程，維持反應(yīng)階段pH在4.3～4.5范圍內(nèi).

2 結(jié)果與討論

2.1 相系統(tǒng)中揮發(fā)性脂肪酸組分變化

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)是評價(jià)產(chǎn)酸相反應(yīng)器運(yùn)行狀況的重要指標(biāo)[4].產(chǎn)酸相及產(chǎn)甲烷VFA總量隨時(shí)間變化如圖2～3所示，在啟動初期，VFA總量較低，在此階段，仍存在少量產(chǎn)甲烷菌屬，接種污泥中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌及產(chǎn)甲烷菌活性較高，將水解發(fā)酵產(chǎn)物降解，轉(zhuǎn)化為CH4及CO2，隨著鉬酸鈉抑制劑的添加，VFA總量呈增長趨勢.在進(jìn)水COD濃度增長到5 000 mg/L時(shí)，其水解產(chǎn)物VFA也隨之增長，從第一階段結(jié)束時(shí)的1 982 mg/L，迅速提高到2 522 mg/L，在運(yùn)行22天后，第二階段結(jié)束VFA總量達(dá)到2 882 mg/L，進(jìn)水濃度達(dá)到8 000 mg/L,產(chǎn)酸相酸化程度達(dá)到穩(wěn)定，出水VFA最高達(dá)到3 963 mg/L.之后負(fù)荷增加，進(jìn)水基質(zhì)降低為5 000 mg/L，VFA總量基本維持在3 000 mg/L左右.

圖2 產(chǎn)酸相VFA及COD變化

圖3 產(chǎn)甲烷相VFA及COD變化

在圖3中，初始出水VFA含量低，主要因?yàn)檫M(jìn)水基質(zhì)是產(chǎn)甲烷菌可直接利用的乙酸，其出水VFA值維持在300 mg/L左右，VFA隨負(fù)荷增加，具有同樣變化趨勢，產(chǎn)酸相進(jìn)水為8 000 mg/L，出水進(jìn)入產(chǎn)甲烷相，其出水VFA最高達(dá)843 mg/L.負(fù)荷提高到10 kg/m3·d，70 d時(shí)，其出水VFA穩(wěn)定在600 mg/L，產(chǎn)酸相與產(chǎn)甲烷相VFA總量差別較大，分相明顯.在初始運(yùn)行階段，乙醇型發(fā)酵菌群的繁殖速度較丙酸型發(fā)酵和丁酸型發(fā)酵菌群而言，繁殖速度慢，最終導(dǎo)致了發(fā)酵類型向丙酸型和丁酸型發(fā)酵方向發(fā)展.

產(chǎn)酸相及產(chǎn)甲烷VFA變化如圖4～5所示.產(chǎn)酸相內(nèi)，在第5天，丙酸的含量占比最大，其次為丁酸，其ORP值為-348 mV，pH值為6.6，其變化的原因可能是由于在不同的pH和ORP條件下，水解酸化菌群耐受的環(huán)境不同.在此環(huán)境下可能更有利于丙酸型丁酸型發(fā)酵菌群的繁殖，丙酸及丁酸得到積累，乙醇乙酸的含量較低.隨著負(fù)荷的提高，底物質(zhì)量濃度較大，食物充足，各類產(chǎn)酸菌適應(yīng)了水質(zhì)環(huán)境，活性提高，有機(jī)酸得到迅速積累，pH及ORP都呈下降趨勢，此時(shí)的環(huán)境適宜于多種混合發(fā)酵菌的生長，乙醇及乙酸占比不斷增加，乙醇+乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從一開始的17%增長到反應(yīng)結(jié)束時(shí)的62%，有較明顯的提高.雖在整個(gè)發(fā)酵過程，丙酸占比最大，但在培養(yǎng)60 d時(shí)，液相末端產(chǎn)物中乙酸占比最大.馬文成等[4]研究得出，乙醇型發(fā)酵易在較高的啟動負(fù)荷下形成，最佳的負(fù)荷范圍為8～12 kg/(m3·d)，且啟動負(fù)荷過低(5 kg/(m3·d)以下)，并輔以較慢的容積負(fù)荷提升幅度，往往易導(dǎo)致丁酸型發(fā)酵.在本實(shí)驗(yàn)中，可能由于啟動負(fù)荷低，更有利于丙酸形成.隨著負(fù)荷的提高，進(jìn)水COD濃度增大，產(chǎn)酸反應(yīng)器中pH下降明顯，比較耐酸的乙醇型發(fā)酵菌群開始迅速繁殖，并與丁酸型、丙酸型發(fā)酵的菌群產(chǎn)生競爭關(guān)系.

圖4 產(chǎn)酸相內(nèi)VFA組分變化

圖5 產(chǎn)甲烷相內(nèi)VFA組分變化

產(chǎn)酸相出水進(jìn)入產(chǎn)甲烷相，在運(yùn)行第10 d測定時(shí)，各組分含量都較低，并無明顯差別，分析其原因可能為，部分以水解發(fā)酵產(chǎn)物為底物的菌種，處于“饑餓期”，當(dāng)產(chǎn)酸相較豐富多種的VFA進(jìn)入到產(chǎn)甲烷相，很快被各種菌降解利用.隨著系統(tǒng)反應(yīng)的運(yùn)行，進(jìn)水基質(zhì)充足，環(huán)境適宜，利用乙醇型發(fā)酵產(chǎn)物的菌群迅速生長繁殖，相比于產(chǎn)酸相出水，乙酸及乙醇在產(chǎn)甲烷相中，均有較高轉(zhuǎn)化率，隨著負(fù)荷提高及產(chǎn)甲烷活性的增強(qiáng)，乙酸的轉(zhuǎn)化率皆高于乙醇，分析原因?yàn)椋孜镛D(zhuǎn)化的速率快慢決定了底物所具有的固有屬性，乙酸相較于乙醇，更易被產(chǎn)甲烷菌屬所利用[3]，也可能是前期污泥馴化的結(jié)果，可利用乙酸的菌種得到富集.由于產(chǎn)甲烷相進(jìn)水基質(zhì)中丙酸含量高，而與其他有機(jī)酸對比，是最不利于被產(chǎn)甲烷菌利用的基質(zhì)，因此在體系中更易得到積累[5].

2.2 兩相系統(tǒng)中COD的去除率

如圖2～3所示，產(chǎn)酸相在初期啟動階段，進(jìn)水濃度為3 000 mg/L時(shí)，其COD去除率達(dá)到68%，并隨著反應(yīng)器運(yùn)行周期的進(jìn)行，去除率下降，之后穩(wěn)定在20%以下，而在啟動后期，負(fù)荷提高，COD去除率減少為12%左右.在反應(yīng)啟動初期，產(chǎn)酸相仍存在產(chǎn)甲烷菌屬，隨著鉬酸鈉的加入，對產(chǎn)甲烷菌屬有致死作用，且不斷酸化的系統(tǒng)，不利于產(chǎn)甲烷菌生長繁殖[6].產(chǎn)酸菌將葡萄糖水解成小分子物質(zhì)及VFA，以便為后一相的產(chǎn)甲烷相利用，而產(chǎn)物都可以COD計(jì)，有其對應(yīng)當(dāng)量，因此其COD去除率不斷下降.COD的去除主要滿足其自身生長.反應(yīng)后期為活性提高期，水解菌活性高，微生物主要將進(jìn)水葡萄糖轉(zhuǎn)化成VFA.產(chǎn)甲烷相具有較高的COD去除率，基本維持在75%～80%左右，因初始進(jìn)水碳源為乙酸鈉，是產(chǎn)甲烷菌可直接利用的基質(zhì)，在將產(chǎn)酸相出水接入到產(chǎn)甲烷相，其去除率并沒有發(fā)生明顯變化.系統(tǒng)培養(yǎng)分相成功，并穩(wěn)定運(yùn)行.

2.3 產(chǎn)酸相中的酸化度

如圖6所示，在培養(yǎng)初期，產(chǎn)酸相內(nèi)酸化率為46.2%，酸化率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)，最高可達(dá)到61.2%，而負(fù)荷的提高，對酸化率產(chǎn)生一定的影響，在整個(gè)反應(yīng)階段負(fù)荷最大時(shí)，其酸化率在45%到48%之間，而在反應(yīng)器穩(wěn)定階段，其酸化率維持在60%左右.馬宏瑞等[7]采用IC反應(yīng)器對不同濃度的毛皮廢水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究得到，在酸化程度達(dá)到45%左右時(shí)，COD去除率及污泥具有穩(wěn)定特性，且活性較高.馬文成等[4]分相研究中，得出酸化度在初期運(yùn)行階段快速上升且幅度變化較大，最高可達(dá)到47.68%，而在負(fù)荷提高后，其值下降，最終穩(wěn)定在27%左右.酸化率的差異與反應(yīng)器類型，水力停留時(shí)間及接種污泥特性都有較大關(guān)系.

圖6 產(chǎn)酸相酸化度變化

2.4 兩相系統(tǒng)中氣體組分變化

經(jīng)史式發(fā)酵管對產(chǎn)氣總量進(jìn)行測定，HRT為6 h時(shí)，產(chǎn)酸反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，每個(gè)周期產(chǎn)氣量約為0.9～1 L左右.由氣相色譜儀測定氣體組分，如圖7所示，主要為CO2及H2，隨著負(fù)荷的提高及反應(yīng)的穩(wěn)定，H2含量在不斷增加，CO2含量在不斷減少，產(chǎn)酸反應(yīng)器中，均未檢測到CH4，產(chǎn)酸相充分水解酸化，同時(shí)抑制產(chǎn)甲烷菌的生長，成功實(shí)現(xiàn)相的分離.

分析原因，可能有三點(diǎn)：

(1)在產(chǎn)酸反應(yīng)器啟動階段，投加了2 mmol/L的鉬酸鈉，其對產(chǎn)甲烷菌是起滅殺作用的，即使在反應(yīng)運(yùn)行3 d后，停止投加鉬酸鈉，產(chǎn)甲烷菌的活性也不能得以恢復(fù)[6].

(2)一般認(rèn)為，產(chǎn)甲烷菌的最適pH為6.8～7.2，在pH低于6.5或高于8.2時(shí)，產(chǎn)甲烷菌都會受到明顯抑制，而在pH低于5.5左右時(shí)，產(chǎn)甲烷菌完全失活.完成進(jìn)水初期，反應(yīng)器內(nèi)pH值為4.8～5.0，整個(gè)反應(yīng)過程中，產(chǎn)酸相的pH范圍在4.3～4.5，對產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生完全抑制.

(3)整個(gè)產(chǎn)酸發(fā)酵過程中，反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定，VFA總量隨負(fù)荷升高，不斷增加，并迅速積累，使得產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的活性由于“連鎖效應(yīng)”而受到抑制[2].綜合以上三個(gè)原因，使得產(chǎn)酸發(fā)酵菌逐漸成為優(yōu)勢菌群，在產(chǎn)生氣體組分中，未檢測到CH4.如圖8所示，在產(chǎn)甲烷相中，CH4占比持續(xù)增加，最終穩(wěn)定在65%左右，表明其產(chǎn)甲烷菌活性增加.Wu Y等[8]在兩相分離實(shí)驗(yàn)研究中，產(chǎn)酸相氣體組分中，CO2濃度超過99.9%，而幾乎沒有H2產(chǎn)生.

圖7 水解酸化反應(yīng)器內(nèi)氣體組分變化

圖8 產(chǎn)甲烷相反應(yīng)器內(nèi)氣體組分變化

2.5 兩相系統(tǒng)中pH變化

由圖9可以看出，在啟動最初階段，由于進(jìn)水基質(zhì)結(jié)構(gòu)較簡單且易分解，初始濃度適宜，各類產(chǎn)酸發(fā)酵菌可迅速適應(yīng)進(jìn)水水質(zhì)，進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)，而抑制劑的添加，使得產(chǎn)甲烷菌滅活，產(chǎn)酸相產(chǎn)生的VFA不被消耗，有機(jī)酸得到快速積累，這一結(jié)果也進(jìn)一步提供了不適宜產(chǎn)甲烷菌生長的環(huán)境，pH值呈迅速下降趨勢.在進(jìn)水配水中，加入適量NaHCO3及NaOH，以調(diào)節(jié)進(jìn)水pH為7.0左右，采用pH探頭實(shí)時(shí)監(jiān)測，基質(zhì)進(jìn)入反應(yīng)器后，完成進(jìn)水，pH在4.8～5.0之間，隨著反應(yīng)器內(nèi)產(chǎn)酸發(fā)酵微生物種群的不斷演替和有機(jī)負(fù)荷的提高，pH值平穩(wěn)下降，最終穩(wěn)定在4.3～4.5，且整個(gè)反應(yīng)階段，未出現(xiàn)“過度酸化”現(xiàn)象，反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定.而產(chǎn)甲烷相出水pH可穩(wěn)定在7.2左右.

圖9 兩相出水pH、ORP值變化

2.6 兩相系統(tǒng)中ORP變化

氧化還原電位，是對微生物生長代謝以及生理生化代謝極其重要的一個(gè)生態(tài)因子，其由所有能形成氧化還原電位的化學(xué)物質(zhì)的存在狀態(tài)決定，生物體細(xì)胞內(nèi)的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在特定的ORP范圍內(nèi)發(fā)生的，超出特定的范圍則生物反應(yīng)不能正常發(fā)生，或會改變反應(yīng)發(fā)生的路徑，且會對反應(yīng)造成不利影響[9,10].

ORP值受溫度及溶解氧的影響，在進(jìn)水時(shí)，不可避免的混入氧分子，使得進(jìn)水時(shí)ORP值在-150 mV左右，在進(jìn)水10分鐘內(nèi)可迅速降至-350 mV以下，這種低氧化還原電位的造成，即是靠水浴加熱以及各類群微生物反應(yīng)及生長對環(huán)境氧化還原電位影響的結(jié)果，ORP值初始進(jìn)水下降較快但之后呈平緩趨勢，變化幅度較小，在進(jìn)水完成后的1 h，ORP基本穩(wěn)定在出水ORP值±10 mV.由圖9可以看出，整個(gè)反應(yīng)過程，出水ORP穩(wěn)定在-400～-500 mV，ORP值較低.產(chǎn)甲烷相，ORP值從初始-400 mV降低到-420 mV，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程ORP值較穩(wěn)定，變化不大.

2.7 兩相系統(tǒng)中的污泥形態(tài)

在污泥接種1～4 d，經(jīng)過足夠長時(shí)間停止攪拌，沉淀，產(chǎn)酸反應(yīng)器出水仍呈灰黑色，污泥洗出量大，主要為沉降性能較差的絮體污泥以及抑制劑鉬酸鈉的加入，洗脫出不具有活性的微生物.在反應(yīng)器運(yùn)行4 d后，污泥逐漸從接種的灰黑色轉(zhuǎn)變?yōu)榛液稚勰噘|(zhì)地松散，呈細(xì)小絮狀.運(yùn)行一周后，污泥沉降性能較好，沉降比約為40%.隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，污泥洗出量逐漸減少，且其活性不斷提高，表觀顏色發(fā)生明顯變化，從剛開始接種的灰黑色到灰褐色，出現(xiàn)淡黃色，最后污泥以乳白色形態(tài)存在，直至反應(yīng)結(jié)束.

本實(shí)驗(yàn)所采用反應(yīng)器為CSTR，因此實(shí)驗(yàn)過程中并未培養(yǎng)成顆粒狀，而成絮體形態(tài).在整個(gè)產(chǎn)酸相反應(yīng)過程中，由于絮凝能力較差的微生物以及處于懸浮狀態(tài)的部分微生物，不適應(yīng)厭氧環(huán)境而被淘汰，或因“沖洗”作用而流失，致使污泥量有較明顯減少，接種階段MLVSS/MLSS=5.424 g/L/10.8 g/L，運(yùn)行15 d，MLSS為7.788 g/L，運(yùn)行23 d，MLSS為7.022 g/L，之后MLSS變化量較小，維持在7.0 g/L左右，基本達(dá)到穩(wěn)定.而產(chǎn)甲烷相反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)過程污泥形態(tài)較穩(wěn)定，呈灰黑色，與接種污泥顏色并無明顯區(qū)別，其運(yùn)行15 d，MLSS為9.623 g/L,運(yùn)行23 d,MLSS為9.964 g/L,至反應(yīng)結(jié)束，其MLSS為10.614 g/L.

對培養(yǎng)成熟后的污泥進(jìn)行掃描電鏡觀察，如圖10～11所示，產(chǎn)酸相中，其菌群主要以短桿菌、芽孢菌及絲狀菌為主，相互滲透且相互纏繞在一起，孔洞交錯(cuò).而產(chǎn)甲烷相，主要以甲烷八疊球菌為主，其占優(yōu)勢.

(a)3 000倍 (b)4 000倍 (c)5 500倍圖10 產(chǎn)酸相污泥電鏡掃描結(jié)果

(d)3 000倍 (e)4 000倍 (f)6 000倍圖11 產(chǎn)甲烷相污泥電鏡掃描結(jié)果

2.8 兩相系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果分析，如圖12所示，在門分類水平，產(chǎn)酸相中大部分菌種都集中Actinobacteria(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)，各個(gè)菌門含量分別為42.46%、36.14%、12.69%、7.97%，表現(xiàn)出較高豐度,其相對豐度之和占細(xì)菌菌群總豐度的99.25%，上述菌群均被報(bào)道是厭氧發(fā)酵技術(shù)處理固廢、廢水及污泥中常見的細(xì)菌菌群[11].在微生物環(huán)境中，Actinobacteria是具有潛在修復(fù)功能的菌種，生長速率快.有研究證明，Actinobacteria中的一些種可以產(chǎn)生大量的水解酶.而Proteobacteria在厭氧水解與酸化系統(tǒng)中，是極其重要的微生物，大多數(shù)互營共生菌都屬于該門，可降解長鏈脂肪酸.Firmicutes可產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和其他細(xì)胞外酶，并與有機(jī)物的降解密切相關(guān)，其具有較好的細(xì)胞壁，可抵抗外界極端環(huán)境[12-14].

而在屬分類水平，如圖13所示，Enterobacteriaceae(腸桿菌屬)，Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)，Corynebacterium(棒桿菌屬)，Bacteroidetes(擬桿菌屬)，Clostridiumsensustricto(梭狀假胞桿菌屬)分別占總量的29.68%、24.42%、11.95%、4.74%、4.75%.這些菌群在有機(jī)物的高效降解中能發(fā)揮重要作用.劉光瑞[15]在進(jìn)水負(fù)荷為7.2 kg COD/m3·d時(shí)，Enterobacteriaceae的相對豐度為36.68%，負(fù)荷提高后豐度降低.陳瑛等[16]認(rèn)為，在厭氧反應(yīng)中產(chǎn)生乙醇型發(fā)酵時(shí)，其主要微生物種群是梭菌屬，而形成丁酸型發(fā)酵時(shí)，主要的微生物種群是Enterobacteriaceae.Clostridiumsensustricto是厭氧環(huán)境中較為常見的菌屬，具有較廣泛的溫度生長范圍，且可利用的基質(zhì)也較豐富，能明顯提高發(fā)酵啟動時(shí)間，其產(chǎn)物主要為乙酸、丁酸及少量丙酸，反應(yīng)體系中一定含量的Clostridiumsensustricto可提高體系發(fā)酵類型的豐富度[17].梭菌和腸桿菌都是產(chǎn)酸發(fā)酵過程污泥中主要的發(fā)酵微生物，劉光瑞[15]發(fā)現(xiàn)，Clostridiumsensustricto具有較寬的pH生長范圍，在pH為4時(shí)仍能正常生長，而Enterobacteriaceae在ph=4時(shí)其生長受到有機(jī)酸抑制，在pH為5～5.5時(shí)，Enterobacteriaceae具有活性強(qiáng).而在本實(shí)驗(yàn)中，pH在4.5附近，Enterobacteriaceae豐度占30%左右，因此可認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)中，腸桿菌屬對低pH的耐受力有很大提高.Bifidobacterium為常見的碳水化合物水解酸化細(xì)菌，其主要代謝產(chǎn)物為乙酸和乳酸.

在產(chǎn)甲烷相中，如圖12所示，門水平，Chloroflexi(綠彎菌門)，Synergistetes(互養(yǎng)菌門)，Bacteroidetes(擬桿菌門)，Thermotogae(熱袍菌門)，分別占總量的36.63%、13.53%、8.74%、7.75%.Chloroflexi其主要屬為Anaerolineaceae(厭氧繩菌屬,36.13%)為嚴(yán)格厭氧的多細(xì)胞絲狀微生物，可利用體系內(nèi)不斷積累的有機(jī)物，為產(chǎn)甲烷菌提供H2，從而降解有機(jī)代謝產(chǎn)物的抑制作用，從而保證厭氧反應(yīng)的穩(wěn)定進(jìn)行[18].互養(yǎng)菌門主要功能是將水解酸化細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸及醇類分解為乙酸、氫及CO2，其在厭氧污泥中與嗜乙酸型甲烷菌形成互營菌群，具有較高豐度，表明菌群互營作用的強(qiáng)化，使體系可以高效運(yùn)行[19].吳凡[20]在對同種接種污泥進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)啤酒廢水的厭氧污泥中Thermotogae含量較小.在本實(shí)驗(yàn)中，保持溫度恒定在35 ℃，經(jīng)過葡萄糖在中溫條件下的馴化后，菌種豐度有明顯提高.在以往的研究中，Thermotogae一般存在于高溫或者極端高溫條件下，而現(xiàn)在也有研究發(fā)現(xiàn)其在中溫環(huán)境中也可生存且豐度較高.在屬水平，Mesotoga(彌索袍菌屬)所占豐度為7.75%，其與厭氧過程系統(tǒng)的穩(wěn)定性有重要作用.Methanosarcina(甲烷八疊球菌)為乙酸裂解菌，可利用乙酸、H2及CO2產(chǎn)生甲烷.Aminivibrio(氨基酸降解菌)與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌為共生關(guān)系.Methanobacterium(甲烷桿菌屬)為氫型產(chǎn)甲烷菌[21,22].

采用同種接種污泥進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)酸相及產(chǎn)甲烷相中菌群作對比，如圖12所示，在門水平，較多菌門發(fā)生明顯變化.Chloroflexi在產(chǎn)酸相豐度占比為0.15%,而在產(chǎn)甲烷相，其值為36.63%，為主要豐度.在產(chǎn)酸相中，Actinobacteria豐度為42.46%，而產(chǎn)甲烷相中，降低到4.31%.這一結(jié)果分析為，較多菌種可在多種復(fù)雜環(huán)境中生存，因?qū)嶒?yàn)中，將產(chǎn)酸相出水進(jìn)入產(chǎn)甲烷中，因此其出水中極可能混有部分菌種，在兩相厭氧中，只是實(shí)現(xiàn)相對分相，各相優(yōu)勢菌種得到富集，而并不能實(shí)現(xiàn)完全分相.

圖12 門分類水平產(chǎn)酸相及 產(chǎn)甲烷相測序結(jié)果

圖13 屬分類水平產(chǎn)酸相及 產(chǎn)甲烷相測序結(jié)果

3 結(jié)論

采用兩個(gè)連續(xù)攪拌厭氧反應(yīng)器進(jìn)行產(chǎn)酸及產(chǎn)甲烷分相培養(yǎng)，產(chǎn)酸相pH維持在4.3～4.5，ORP為-400～-500 mV.產(chǎn)甲烷相pH維持在7.2左右，ORP為-400～-420 mV.得到的結(jié)論如下：

(1)在產(chǎn)酸與產(chǎn)甲烷分相培養(yǎng)的過程中，隨著進(jìn)水負(fù)荷的增大，產(chǎn)酸相COD去除率從初期的68%降低到12%，當(dāng)進(jìn)水負(fù)荷穩(wěn)定在10 kg/m3·d時(shí)，酸化率穩(wěn)定在45%左右.產(chǎn)酸相始終呈丙酸型發(fā)酵.產(chǎn)甲烷相COD去除率在75%～80%.兩相反應(yīng)特征明顯.

(2)兩相培養(yǎng)過程中，產(chǎn)酸相污泥顏色從開始的灰黑色逐漸變化為灰褐色、淡黃色，最后為乳白色，菌群的形態(tài)主要為短桿菌、芽孢菌及絲狀菌.產(chǎn)甲烷相污泥始終呈灰黑色，菌群的形態(tài)主要為甲烷八疊球菌.

(3)根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，產(chǎn)酸相中優(yōu)勢菌屬為Enterobacteriaceae(腸桿菌屬)，Bifidobacterium(雙歧桿菌科)，Corynebacterium(棒桿菌屬)，Bacteroidetes(擬桿菌)，Clostridiumsensustricto(梭狀假胞桿菌屬).產(chǎn)甲烷相中優(yōu)勢菌屬為Anaerolineaceae(厭氧繩菌屬)，Aminivibrio(氨基酸降解菌)，Mesotoga(彌索袍菌屬)，Methanobacterium(甲烷桿菌屬)，Methanosarcina(甲烷八疊球菌).