陜甘寧青晉東方蜜蜂線粒體DNA COⅠ序列遺傳多樣性分析

劉意秋, 馮毅楠, 周丹銀, 龔雪陽, 趙文正, 董 坤, 和紹禹

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所;2.云南省蜜蜂資源可持續(xù)利用工程中心，云南 昆明 650201)

東方蜜蜂在分類系統(tǒng)中屬于膜翅目、蜜蜂總科、蜜蜂科、蜜蜂屬(Apis)、東方蜜蜂種，學(xué)名為ApisceranaFabrieus，上世紀三十年代開始對其進行人工活框飼養(yǎng).東方蜜蜂是重要的經(jīng)濟昆蟲和授粉昆蟲，而且還是研究社會性行為的重要模式生物[1-4].東方蜜蜂與許多顯花植物種類保持著密切的互利協(xié)作關(guān)系，顯花植物為蜜蜂提供花蜜和花粉作為食物，而蜜蜂在采集花蜜、花粉的過程中，為這些顯花植物傳播花粉.作為真社會性昆蟲，東方蜜蜂過著群體生活，在自然條件下筑巢于石洞或樹洞中.自然蜂群通常由三型蜂組成，即1只卵巢發(fā)育正常的專司產(chǎn)卵的蜂王，幾百或上千只僅在繁殖季節(jié)出現(xiàn)專司交配的雄蜂，以及數(shù)千到幾萬只卵巢發(fā)育不完全的工蜂.工蜂是蜂群中數(shù)量最多，個體最小的成員，承擔著蜂群社會除交尾和產(chǎn)卵之外的一切工作(在有些失去蜂王的蜂群中，工蜂也會產(chǎn)卵)，如：采集花蜜、花粉、水和無機鹽，飼喂幼蟲，清理巢房，振翅調(diào)節(jié)蜂巢的溫度，防御外敵等.

黃河自青海發(fā)源，綿延向東貫穿甘肅、寧夏、陜西、山西.位于黃河中上游的這5個省、自治區(qū)境內(nèi)有著獨特的地形地貌和氣候環(huán)境，秦嶺山脈、六盤山、呂梁山等山林提供了豐富的生物多樣性，為東方蜜蜂創(chuàng)造了良好的生存條件.

目前國內(nèi)外學(xué)者利用形態(tài)學(xué)[5-8]和分子標記[9-11]等分析方法，對我國東方蜜蜂進行遺傳分布與地理結(jié)構(gòu)之間相關(guān)性的研究，但是并沒有使我國東方蜜蜂的分類觀點趨于統(tǒng)一，不同學(xué)者的研究結(jié)果或印證了前人的研究，或與前人的研究觀點不一致.因此，對陜甘寧青晉東方蜜蜂遺傳多樣性的調(diào)查十分必要.

本研究采集該區(qū)域15個不同采樣點的東方蜜蜂，共443群.通過擴增線粒體DNA(mtDNA)的細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因部分序列，研究該區(qū)域東方蜜蜂群體的遺傳變異、群體間遺傳關(guān)系和遺傳分化情況.與國內(nèi)外相關(guān)的東方蜜蜂序列進行同源比對，分析其親緣關(guān)系，對該區(qū)域東方蜜蜂樣本進行較大范圍的遺傳變異檢測，綜合評價其遺傳分化狀況不僅能促進該區(qū)域東方蜜蜂資源的深入研究，還能為保護和選育東方蜜蜂的種質(zhì)資源提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗中所用的東方蜜蜂樣本采集于青海、甘肅、寧夏、陜西和山西5個省、自治區(qū)，共15個采樣點(表1)，陜西省西安市(SXXA)為23群，其余每個采樣點30群，共443群(均為人工飼養(yǎng)).每群隨機采集30～50只，以無水乙醇浸泡，放置于-80 ℃超低溫冷凍冰箱中備用.

表1 東方蜜蜂樣本采集信息Table 1 The information about sampling sites of A.cerana

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 每群隨機取1只工蜂，除去頭和腹部，將胸部置于1.5 mL離心管中，30 ℃烘干，加450 μL STE緩沖液，用玻璃研磨棒加石英砂充分研磨后，加入 10% SDS 100 μL和40 μL蛋白酶K，55 ℃水浴鍋消化24 h.然后采用常規(guī)的酚-氯仿法提取蜜蜂DNA.加TE緩沖液溶解，68 ℃滅活4 h，室溫靜置，放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

表2 線粒體COⅠ引物Table 2 Primers for mtDNA COⅠ

1.2.2 引物設(shè)計及目標片段PCR擴增 用已發(fā)表的東方蜜蜂(A.cerana)線粒體全基因組(NCBI登陸號：L06178)為模板，利用Primer 5軟件設(shè)計引物(表2).其中，正向引物COⅠ-F和反向引物COⅠ-R的目標片段為細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因部分序列(COⅠ)，長度約910 bp.引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，滅菌超純水溶解使其終濃度為20 mmol·μL-1，靜置24 h使其充分溶解于滅菌超純水中，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?

利用PCR技術(shù)擴增mtDNA COⅠ基因(表3)，反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性5 min；然后，94 ℃變性20 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，終止反應(yīng).PCR產(chǎn)物純化并由上海生工生物工程有限公司進行單向測序.

1.2.3 序列分析和用于比對的序列來源 首先用Lasergene 7.1對測序結(jié)果進行核對、校正，確定出無誤的

表3 線粒體DNA COⅠ PCR反應(yīng)體系Table 3 PCR reaction system for mtDNA COⅠ

序列.由MEGA5打開并用 Clustal W排序，生成供系統(tǒng)發(fā)育分析的矩陣，計算組間遺傳距離，分析序列的堿基組成及構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹；用DnaSP計算單倍型多樣性(H)和核苷酸多樣性(π)；用Arlequin軟件將各地區(qū)樣本進行分組，并進行mantel檢驗和AMOVA分析；最后用MRbayes軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷酸組成及群組變異位點分析

對試驗中5個省15個采樣點共443群東方蜜蜂線粒體DNA (mtDNA) COⅠ片段的測序，共得到443條可用序列，對每條可用序列進行人工校正和修剪后，得到可用于數(shù)據(jù)分析的序列，長度為625 bp.序列計算后得到的平均堿基組成為：A=33.4%、T=40.6%、C=13.5%、G=12.5%，其中A+T的含量為74%，明顯高于 C+G的含量26%.序列共發(fā)現(xiàn)19個變異位點，其中簡約信息位點16個，單一變異位點3個，不包括堿基插入/缺失.這19個變異位點中轉(zhuǎn)換變異位點18個，顛換變異位點1個(表4).

表4 線粒體DNA單倍型及變異位點1)Table 4 Mitochondrial DNA polymorphic site and haplotype of A.cerana

1)表頭數(shù)字代表發(fā)生堿基變異的堿基位置，CH1為單倍型參考序列，“·”代表與參考序列相同.

共定義了21個線粒體單倍型.將21種單倍型進行命名，命名規(guī)則： “CH+數(shù)字”，單倍型多樣性0.536±0.029，核苷酸多樣性0.001 16±0.000 08.各個地理種群間的單倍型多樣性為0.129～0.832，核苷酸多樣性為0.000 21～0.002 21(表5).

2.2 各個采樣點間東方蜜蜂的遺傳距離

組間遺傳距離、核苷酸凈遺傳距離(Da)、核苷酸差異平均數(shù)(Kxy)、核苷酸分歧度(Dxy)均為反應(yīng)群體間核苷酸差異多態(tài)性的重要指標.將每個采樣點的東方蜜蜂分為1組，共15組，利用MEGA 5.1軟件以kimura 2-parameter model對這15組東方蜜蜂進行組間遺傳距離的計算(表6).以同樣的分組，利用DnaSP 5.1計算核苷酸凈遺傳距離(Da)、核苷酸差異平均數(shù)(Kxy)、核苷酸分歧度(Dxy)，分別見表6和表7.組間遺傳距離的變化范圍0.000 11～0.002 48；核苷酸凈遺傳距離(Da)的變化范圍0.000 11～0.002 77；核苷酸分歧度(Dxy)的變化范圍0～0.002 80；核苷酸差異平均數(shù)(Kxy)的變化范圍0.067～1.733.

表5 種群單倍型多樣度與核苷酸多樣度1)Table 5 The haplotype diversity and nucleotide diversity of A.cerana

1)N樣本量；h單倍型種類數(shù)；u獨有單倍型種類數(shù)； Hd單倍型多樣度；π 核苷酸多樣度；SD標準差； Tajima中性檢驗D值；FsFu′s中性檢驗Fs值；*0.01

表6 東方蜜蜂組間遺傳距離(下三角)和核苷酸凈遺傳距離(Da)(上三角)Table 6 The genetic distance between groups (blow the diagonal) and net nucleotide divergence (above the diagonal) among A.cerana populations

表7 東方蜜蜂核苷酸差異平均數(shù)(Dxy)(下三角)和核苷酸分歧度(Kxy)(上三角)Table 7 Average number of nucleotide differences (blow the diagonal) and nucleotide divergence (above the diagonal) among A.cerana populations

2.3 Mantel test和AMOVA檢驗分析

采用MEGA生成的遺傳距離矩陣(表6)和通過網(wǎng)絡(luò)地圖查詢的各個采樣點之間的地理矩陣(表8)對15個采樣點的東方蜜蜂進行蒙特爾檢驗，r為-0.027，P為0.492，由于P>0.05，因此陜甘寧青晉各采樣點間東方蜜蜂的核苷酸變異程度并未與地理距離呈現(xiàn)相關(guān)性.

表8 東方蜜蜂采樣點的地理距離Table 8 The geographical distance of A.cerana

為了更進一步探討種群間的遺傳差異程度，針對15個采樣點東方蜜蜂進行分子方差分析(AMOVA檢驗).結(jié)果表明(表9)：采樣點之間遺傳分化不顯著.以各省為分組的結(jié)果表明：組間變異程度占的比重較低，變異不顯著，而組內(nèi)群體間和群體內(nèi)的變異極顯著.相比較而言，將山西單獨分為1組時，組間變異程度占比重較大，達到顯著水平，說明山西省的東方蜜蜂群體與其他省區(qū)有著一定的遺傳分化現(xiàn)象，這可能是由于呂梁山的阻隔，一定程度上限制了東方蜜蜂群體間的基因交流.

表9 東方蜜蜂線粒體DNA分子方差分析1)Table 9 AMOVA test of A.cerana

1)“**”表示P<0.01(差異極顯著)，F(xiàn)CT表示組間變異固定指數(shù)；FSC表示組內(nèi)群體間變異固定指數(shù)；FST表示群體內(nèi)變異固定指數(shù).

2.4 單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

將已命名的21種單倍型用NETWORK軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1).從圖中可以看出，樣本采集區(qū)域的東方蜜蜂種群并沒有較大的遺傳分化.單倍型CH1分布最為廣泛，在5個省區(qū)的東方蜜蜂樣本中均為最主要的單倍型.

圖中空心進化過程中可能出現(xiàn)的單倍型，黑色實心圓代表突變過程.圖1 陜甘寧青晉東方蜜蜂的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.1 The network structure of haploid type of A.cerana in Shanxi, Shaanxi, Ningxi, Gansu, Qinghai

選擇表10中的9條東方蜜蜂DNA序列、原有未發(fā)表的2條西藏東方蜜蜂DNA序列，以及本研究中采自陜甘寧青晉15個采樣點的21種長度為625 bp的單倍型DNA序列，經(jīng)軟件整理后得到長度為613 bp的32條同源序列.利用DnaSP 5.1軟件分析這些序列后，鑒別出30種相應(yīng)的單倍型，對單倍型進行命名，命名規(guī)則：“CH+數(shù)字”代表本研究所采集樣本中的單倍型；“地區(qū)字母縮寫+數(shù)字“代表外群序列單倍型；“S+數(shù)字”代表共享單倍型.然后用NETWORK軟件構(gòu)建試驗樣本與外部種群的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖2).結(jié)果表明，樣本區(qū)域東方蜜蜂群體與廣東、西藏、越南等地親緣關(guān)系較近；而與海南島、馬來西亞、印度尼西亞等地親緣關(guān)系較遠.

表10 東方蜜蜂參考序列基本信息Table 10 The information of reference sequences of A.cerana

圖2 東方蜜蜂種群的mtDNA COⅠ單倍型序列與國內(nèi)外同源序列比對Fig.2 The network structure of mtDNA COⅠ haplotype for 15 A.cerana populations compared with domestic and abroad homologous sequence

2.5 5省區(qū)東方蜜蜂系統(tǒng)進化樹構(gòu)建分析

以TreeGraph軟件將貝葉斯法、最大簡約法、鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的支持率整合在一起(圖3)，樹枝上的支持率依次為：貝葉斯法后驗概率、鄰接法自檢舉支持率、最大簡約法自檢舉支持率.利用3種構(gòu)建方法得到的系統(tǒng)樹結(jié)構(gòu)基本一致，只有一些分支上的支持率存在差異.從系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所檢測的陜甘寧青晉地區(qū)東方蜜蜂種群聚類集中，沒有顯著的遺傳差異性，廣東、廣西和越南種群遺傳分化較??；而與海南、馬來西亞和印度尼西亞地區(qū)的東方蜜蜂存在較大的遺傳變異，應(yīng)屬于不同的亞種，這與network網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖所得出的結(jié)論相似.

3 討論與小結(jié)

3.1 陜甘寧青晉東方蜜蜂mtDNA COⅠ序列特征

圖3 mtDNA COⅠ單倍型序列與國內(nèi)外同源序列比對的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic structure of mtDNA COⅠ haplotype of 15 A.cerana populations compared with domestic and abroad homologous sequence

線粒體DNA是動物細胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，有著豐富的遺傳信息，主要進行母系遺傳，其基因重組率小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快，在種間、種內(nèi)群體間及群體內(nèi)具有普遍的多態(tài)性的特點，所以在探索物種起源、演化以及重建系統(tǒng)發(fā)育史中作為重要的遺傳標記[13-15].本次研究的15個采樣點的443個東方蜜蜂樣本COⅠ序列長度為625 bp，序列中堿基的平均組成為：A=33.4%、T=40.6%、C=13.5%、G=12.5%，其中A+T的含量為74%，高于 C+G的含量26 %，低于譚宏偉等[12]人測定的東方蜜蜂全基因組序中A+T含量(83.9%)，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基組成偏倚性，與一般生物體線粒體DNA 的A+T含量比較高的特點相符合[16].與其它科的昆蟲相比A+T含量高，如蜻蜓目差翅亞目昆蟲A+T含量為69.6%[17]，半翅目椿亞科昆蟲A+T含量為70%[18].與其他關(guān)于東方蜜蜂線粒體DNA 序列的報道相比較低，高鵬飛等[19]的研究結(jié)果中A、T、C和G堿基平均含量分別是33.0%、44.0%、13.8%和9.2%，A+T含量為77%；郭新軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA非編碼區(qū)的A+T含量為86.1%；丁桂玲等[21]研究線粒體DNA非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)A+T含量為86.84%.蜜蜂mtDNA不同基因區(qū)域的A+T含量也不一樣，在A+T富集區(qū)，其含量可高達96%[22].

陜甘寧青晉15個采樣點東方蜜蜂序列中共發(fā)現(xiàn)19個變異位點，其中單一變異位點(singleton variable dites)3個，簡約信息位點(parsimony information sites)16個，轉(zhuǎn)換(transition)變異位點18個，顛換(transversion)變異位點1個.共定義了21個線粒體單倍型(mitotype).姜玉鎖等[23]研究中國境內(nèi)東方蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ區(qū)域發(fā)現(xiàn)，11個樣本中有9個變異位點，其中8個轉(zhuǎn)換位點和1個顛換位點.譚墾等[24]研究亞洲部分地區(qū)的東方蜜蜂mtDNA發(fā)現(xiàn)，序列中存在8個轉(zhuǎn)換和1個顛換位點.高鵬飛等[19]研究中國境內(nèi)的東方蜜蜂mtDNACytb部分序列發(fā)現(xiàn)，序列中的13個變異位點有9個轉(zhuǎn)換位點和4個顛換位點.在線粒體基因組DNA進化過程中，轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率要比顛換高，可能與分歧較近的物種間編碼區(qū)DNA序列較多發(fā)生同義突變的結(jié)果有關(guān).

3.2 遺傳多樣性與遺傳分化分析

本研究中的東方蜜蜂樣本總的單倍型多樣度為0.536±0.029，核苷酸多樣度為：0.001 16±0.000 08，說明采樣地區(qū)東方蜜蜂種群具有一定的遺傳分化，但不同地理種群間差異程度不同.中性檢驗用于推測各個地理種群在進化歷程上所經(jīng)歷的微進化事件，判斷地理種群間是否經(jīng)歷過種群擴張或者縮減現(xiàn)象的指標.

GSQS的Tajima′s D和Fu′sFs中性檢驗中均呈顯著的負值，表明該群體近期有可能發(fā)生了一定的種群擴張，其中QHMH的Fu′sFs值呈現(xiàn)極顯著的負值，表明該群體在近期有可能發(fā)生了種群的擴張，同時QHMH和NXJY2的Fu′sFs值也為極顯著或顯著的負值；而其他群體的中性檢驗都呈現(xiàn)不顯著的正值或負值，表明在進化過程中相對保守，沒有經(jīng)歷種群擴張或種群縮減等較大的變化.

組間遺傳距離、核苷酸凈遺傳距離(Da)、核苷酸差異平均數(shù)(Kxy)、核苷酸分歧度(Dxy)均為反應(yīng)群體間核苷酸差異多態(tài)性的重要指標.經(jīng)檢測，15個采樣點東方蜜蜂組間遺傳距離的變化范圍0.000 11～0.002 48，核苷酸凈遺傳距離(Da)的變化范圍在：0.000 11～0.002 77核苷酸差異平均數(shù)(Kxy)的變化范圍在：0.067～1.733，核苷酸分歧度(Dxy)的變化范圍在：0～0.002 80.

蒙特爾檢驗結(jié)果表明，15個采樣點的東方蜜蜂的遺傳變異與地理距離間無顯著的相關(guān)性. Smith et al[25]認為分布于東南亞至北亞的東方蜜蜂在經(jīng)歷了更新世紀冰期之后可能發(fā)生了群體擴張事件，緬甸、越南、柬埔寨和老撾等東方蜜蜂線粒體多態(tài)性較高，這些地區(qū)可能在更新世的冰川活動期作為東方蜜蜂的“避難所”.如果此推論成立，當冰川退去后東方蜜蜂由此向北和東擴展就形成了我國目前東方蜜蜂多樣性分布格局.AMOVA分析所得結(jié)果顯示：組間的變異率較小而組內(nèi)群體間和群體內(nèi)的變異率較大，說明群體內(nèi)的基因交流更為頻繁，而群體間基因交流相對較弱，同時一部分地理種群仍然保留著一定的特異性，這可能與該地區(qū)的東方蜜蜂長期處于傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式有關(guān).

東方蜜蜂種群內(nèi)存在著豐富的遺傳多樣性.本研究中所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型Network關(guān)系圖顯示：本研究中的樣本與西藏、廣東、越南等內(nèi)陸地區(qū)的東方蜜蜂間遺傳差異相對較?。欢c海南、馬來西亞、印度尼西亞等海島上的東方蜜蜂地理種群間存在較大的遺傳差異.此現(xiàn)象可能是長時間的海島隔離阻斷基因交流造成的.

3.3 小結(jié)

(1)陜甘寧青晉地區(qū)的東方蜜蜂地理種群間遺傳差異相對較小.(2)陜甘寧青晉地區(qū)的東方蜜蜂與廣東、西藏、越南等地區(qū)的東方蜜蜂間存在相對較小的遺傳差異.(3)陜甘寧青晉地區(qū)的東方蜜蜂與海南、馬來西亞、印度尼西亞等海島的東方蜜蜂間存在相對較大的遺傳差異.