圓齒野鴉椿中isobiflorin和biflorin的超聲提取工藝

李艷蕾, 黃閏玲, 邱亞鐵, 陳景新, 張雅萍, 姚詩茹, 鄒雙全, 倪 林2,, 蔡文杰， 胡亞林

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002；4.臺灣成功大學(xué)熱帶植物研究所，臺灣 臺南 701)

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)為省沽油科野鴉椿屬植物，又名福建野鴉椿，是我國特有珍稀藥用觀賞樹種，富含三萜[1-3]、倍半萜[4]、酚酸類[5-6]、生物堿[7]等成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕的藥用功效[8].近年來，該樹種在福建、江西等省的種植面積不斷擴大，僅福建三明清流、泰寧，南平邵武、建陽，泉州德化等地就超過300 hm2.本課題組一直致力于圓齒野鴉椿藥用價值的開發(fā)與利用研究，并從圓齒野鴉椿果皮中分離、鑒定出色原酮碳苷類成分isobiflorin和biflorin，且含量高于含有這兩種成分的其他植物[9].已有研究表明，isobiflorin和biflorin有很強的抗炎[10]、抗氧化[11]、抗消化道功能紊亂[12]等活性.其中，抗炎活性尤為突出，15 mg·kg-1biflorin產(chǎn)生的藥效與100 mg·kg-1布洛芬相當[10].如何有效從圓齒野鴉椿果皮中提取isobiflorin和biflorin成為當前亟待解決的問題.因此，本課題組采用響應(yīng)面法[13-14]優(yōu)化超聲提取圓齒野鴉椿中isobiflorin和biflorin的工藝，為圓齒野鴉椿果皮提取物的高效利用提供參考，也為色原酮碳苷類化合物藥用價值的開發(fā)做前期準備.

1 材料與方法

1.1 藥材、藥品與試劑

樣品為2017年10月采收的成熟期圓齒野鴉椿果實的外果皮，采自福建三明清流圓齒野鴉椿種植基地，樣品存于福建農(nóng)林大學(xué)制藥工程系；isobiflorin和biflorin對照品為實驗室自制，其ESI-MS、1H、13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[15-16]完全一致，經(jīng)HPLC測定，歸一化法計算，質(zhì)量分數(shù)為99%以上.甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

Waters W2695-W2998高效液相色譜儀(美國沃特世公司)，CPA225D型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)，KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司).

1.3 isobiflorin和biflorin含量測定方法

1.3.1 HPLC分析條件 Dikma Diamonsil(C18250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為甲醇—水(25∶75)等度洗脫，檢測波長256 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，色譜條件與文獻[9]相同.

1.3.2 對照品溶液制備與標準曲線的繪制 精密稱取對照品isobiflorin和biflorin各2 mg，加入甲醇溶解，定容至2 mL，配制成1 mg·mL-1的對照品溶液，搖勻，備用.將配制的對照品溶液按1.3.1的條件進行檢測，對照品溶液分別進樣2、4、6、8、10 μL,得到相應(yīng)的峰面積后繪制標準曲線.

1.3.3 圓齒野鴉椿果皮超聲提取法流程 將圓齒野鴉椿果皮在50 ℃下烘干至恒重，粉碎后過篩，取粒徑≤0.178 nm的粉末備用.精密稱取2 g處理后的樣品粉末，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入一定體積相應(yīng)濃度的乙醇，稱定，超聲提取(40 kHz、250 W).取出靜置至室溫，稱定并補足質(zhì)量，吸取提取液適量，過濾，取續(xù)濾液，按1.3.1的方法進樣檢測.

1.4 圓齒野鴉椿超聲提取工藝參數(shù)的單因素試驗

以isobiflorin和biflorin的總提取率為評價指標，分別考察提取時間、乙醇體積分數(shù)及液料比對提取率的影響.

isobiflorin和biflorin的總提取率/%=isobiflorin提取質(zhì)量+biflorin提取質(zhì)量圓齒野鴉椿藥材質(zhì)量×100

1.4.1 提取時間對提取率的影響 固定液料比25∶1，乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間分別為10、20、30、40、50 min，按1.3.3的方法進行試驗.

1.4.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 固定液料比25∶1，提取時間40 min,乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，按1.3.3的方法進行試驗.

1.4.3 液料比對提取率的影響 固定提取時間為40 min,乙醇體積分數(shù)為60%，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，按1.3.3的方法進行試驗.

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factor level of response surface

通過單因素試驗得出提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比3個因素的水平值(表1)，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析.共設(shè)計17個試驗，中心點重復(fù)試驗5次.

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測結(jié)果

據(jù)1.3.1檢測得到對照品與樣品色譜圖(圖1).

t保留=7.764 min為化合物isobiflorin；t保留=10.065 min為化合物biflorin.圖1 對照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and sample (B)

2.2 標準曲線

isobiflorin和biflorin的標準曲線見圖2.isobiflorin的標準曲線的線性回歸方程為y=7×106x+158 143，R2=0.999 9；biflorin的標準曲線的線性回歸方程為y=5×106x+132 735，R2=0.999 9.

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 提取時間對提取率的影響 由圖3可以看出,隨著提取時間的延長，isobiflorin和biflorin的總提取率呈上升趨勢，在40 min時達最大值，之后提取率下降.故選擇40 min為最優(yōu)超聲提取時間.

圖2 對照品isobiflorin和biflorin的標準曲線Fig.2 Linear range of isobiflorin and biflorin

圖3 提取時間對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate

2.3.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 由圖4可以看出,乙醇體積分數(shù)對isobiflorin和biflorin提取率的影響較為顯著.隨著體積分數(shù)增大，提取率先升后降，當乙醇體積分數(shù)為60%時，isobiflorin和biflorin的提取率最高.故選擇60%乙醇為最優(yōu)提取溶液.

2.3.3 液料比對提取率的影響 由圖5可知，15∶1為最優(yōu)提取液料比.

圖4 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction rate

圖5 液料比對提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction rate

2.4 響應(yīng)面分析

2.4.1 響應(yīng)面回歸模型建立與方差分析 根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果(表2)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多項式回歸擬合，得到isobiflorin和biflorin提取率(Y)與提取時間(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、液料比(C)的回歸模型：Y=-3.744+2.71×10-2A+9.53×10-2B+1.06×10-1C-5.0×10-5AB-4.0×10-4AC-2.5×10-4BC-1.98×10-4A2-7.23×10-4B2-2.49×10-3C2.對該回歸模型進行方差分析(表3)可知，該回歸模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.289 0>0.05)，決定系數(shù)R2=0.988 6，說明該模型與試驗數(shù)據(jù)擬合程度較高.

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Result of response surface test

表3 響應(yīng)面方差分析1)Table 3 Variance analysis of response surface

1)*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01).

回歸模型中各項的顯著性：一次項A極顯著(P=0.000 3<0.01)，B極顯著(P<0.000 1)，C不顯著(P=0.309 1>0.05)，說明影響isobiflorin和biflorin提取率的因素依次為乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比；二次項A2顯著(P=0.004 1<0.05)，B2極顯著(P<0.000 1)，C2極顯著(P<0.000 1)；三次項AB交互作用不顯著(P=0.335 6>0.05)，AC交互作用顯著(P=0.004 4<0.05)，BC交互作用顯著(P=0.036 2<0.05).總之，3個影響因子對isobiflorin和biflorin提取率的影響較為復(fù)雜，不是簡單的線性關(guān)系，曲面效應(yīng)顯著.

2.4.2 等高線圖與響應(yīng)曲面圖分析 由圖6可以看出，提取時間與乙醇體積分數(shù)對于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用不顯著，當提取時間為40 min、乙醇體積分數(shù)為60%時，提取率達到最大；由等高線圖可知，乙醇體積分數(shù)相較于提取時間對提取率的影響更為顯著.從圖7可以看出，提取時間與液料比對于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用顯著(P<0.05)，主要表現(xiàn)為當提取時間逐漸延長時，提取率先逐漸增大后趨于平穩(wěn)，當液料比逐漸增大時，提取率呈先增大后減小的趨勢；當提取時間為40 min、液料比為15∶1時，isobiflorin和biflorin的提取率達到最大.由圖8可知，乙醇體積分數(shù)和液料比對于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用顯著(P<0.05)，當乙醇體積分數(shù)為60%、液料比為15∶1時，提取率達到最大；從等高線圖可知，乙醇體積分數(shù)對提取率的影響比液料比更為顯著.

圖6 提取時間與乙醇體積分數(shù)對提取率影響的等高線圖(左)和響應(yīng)曲面圖(右)Fig.6 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate

圖7 提取時間與液料比對提取率影響的等高線圖(左)和響應(yīng)曲面圖(右)Fig.7 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of extraction time and liquid-to-solid ratio on extraction rate

圖8 乙醇體積分數(shù)與液料比對提取率影響的等高線圖(左)和響應(yīng)曲面圖(右)Fig.8 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of ethanol concentration and liquid-to-solid ratio on extraction rate

2.5 驗證試驗

通過響應(yīng)面分析得到超聲提取圓齒野鴉椿中isobiflorin和biflorin的最佳工藝條件：提取時間46 min，乙醇體積分數(shù)62%，液料比15∶1，該條件下提取率的預(yù)測值為0.601%.為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在上述工藝條件下試驗3次.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總提取率為(0.602±0.002)%，與預(yù)測值接近，兩者的相對誤差為0.17%，表明響應(yīng)面法建立的回歸模型與真實試驗結(jié)果擬合程度較高，優(yōu)化的工藝條件可靠.

3 討論

響應(yīng)面設(shè)計是一種有效的統(tǒng)計和優(yōu)化方法，與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計和正交設(shè)計相比，響應(yīng)面法具有試驗精度高、試驗次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好等優(yōu)點，且能反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系.故本試驗以色譜圖中共有峰的總峰面積為響應(yīng)值，運用Design-Expert 軟件進行Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計，對isobiflorin和biflorin提取工藝進行優(yōu)化，最終確定超聲提取圓齒野鴉椿中isobiflorin和biflorin的最佳工藝條件：提取時間46 min，乙醇體積分數(shù)62%，液料比15∶1，其提取率為0.601%.

已有文獻報道，isobiflorin和biflorin存在于鱗毛蕨科粗莖鱗毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[17]、石蒜科全能花(Pancratiumbiflorum)[15]、桃金娘科丁香(Syzygiumaromaticum)[16]等植物中；在現(xiàn)有工藝條件下，從丁香中獲得的isobiflorin最多，但得率僅為0.1%，可利用率低.采用響應(yīng)面法優(yōu)化圓齒野鴉椿中isobiflorin和biflorin的超聲提取工藝，提取率可達0.6%，且圓齒野鴉椿資源豐富，因此開發(fā)利用潛力較大.