金觀音與其親本差異基因表達(dá)的遺傳分析

姚雪倩, 鄭玉成, 王鵬杰, 林 浥, 鄭知臨, 陳桂信, 葉乃興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.閩侯縣農(nóng)業(yè)局，福建 閩侯 350100)

茶樹是多年生異花授粉植物，遺傳背景復(fù)雜，雜合程度很高，雜種優(yōu)勢的利用難度較大[1].鐵觀音和黃旦是烏龍茶的主栽品種，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所以鐵觀音為母本，黃旦為父本，從其雜交后代中選育出金觀音、黃觀音、金玫瑰、金牡丹等早生優(yōu)質(zhì)新品種[2].金觀音，又名茗科1號，是福建省推廣面積最大的烏龍茶新品種[3].金觀音的生育期、芽葉色澤、成茶品質(zhì)等農(nóng)藝性狀與親本存在差異，在產(chǎn)量、香氣品質(zhì)和抗逆性等方面均超過父母本，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢[4].目前關(guān)于金觀音與其親本間的差異研究只停留在親子代間的形態(tài)特征、生理生化特性、制茶品質(zhì)等方面[4]，用遺傳學(xué)理論來闡釋茶樹親子代間差異基因表達(dá)的機(jī)理還鮮見報(bào)道.

本試驗(yàn)從金觀音與其親本間的差減文庫中篩選出與生長發(fā)育、逆境脅迫、次生代謝有關(guān)的差異基因，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測其表達(dá)量的變化，分析差異基因的表達(dá)模式；并檢測具有超高親表達(dá)和低于雙親表達(dá)模式的基因在其他兩個F1黃觀音和金玫瑰上表達(dá)量的差異，旨在為揭示差異基因在雜種和親本上的遺傳規(guī)律提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

2016年3月中旬至4月中旬于福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)教學(xué)茶場，以中小開面葉為標(biāo)準(zhǔn)采摘鐵觀音(♀)、黃旦(♂)及3個F1品種金觀音、黃觀音和金玫瑰的一芽二葉.每個品種分別稱取3份以上，每份0.2 g，用錫箔紙包裹，做好標(biāo)記，放入液氮速凍后，轉(zhuǎn)入冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆?

1.2 方法

1.2.1 金觀音與其親本差異基因的篩選 建庫和篩選參照前人[5-7]的方法進(jìn)行.以金觀音及其親本的春茶嫩梢為供試材料，采用雙鏈特異性核酸酶(DSN)介導(dǎo)的抑制差減雜交技術(shù)，構(gòu)建金觀音—鐵觀音及金觀音—黃旦兩個正向差減cDNA文庫，采用反向印跡雜交技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的方法篩選這兩個正向差減cDNA文庫，獲得差異基因的陽性克隆.將陽性克隆的測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其生物學(xué)功能，并將這些差異基因進(jìn)行歸類.

1.2.2 金觀音與其親本差異基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析 以金觀音、鐵觀音和黃旦的一芽二葉為材料，以天根RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides & Polyphenolics-rich)植物多糖多酚試劑盒提取的總RNA為模板，按照全式金的EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒方法合成的cDNA作為熒光定量PCR的模板.根據(jù)兩個差減文庫中篩選得到的參與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)基因的cDNA序列，以茶樹GAPDH(KC337052.1)為內(nèi)參基因[8]，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(部分引物見表1).熒光定量PCR反應(yīng)體系含5 μL 2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix、上下游引物各0.2 μL、1 μL Template DNA ，用ddH2O補(bǔ)至10 μL；程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán).每一個基因模板設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)通過Bio-Rad CFX 3.1熒光定量PCR儀完成.數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2003軟件和2-△△Ct法[9]進(jìn)行定量分析.

表1 熒光定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.2.3 金觀音與其親本差異基因表達(dá)量的比較及篩選 以F1金觀音的熒光定量表達(dá)量高于母本鐵觀音或父本黃旦之一較高的表達(dá)量稱為超高親表達(dá)量，具有雜種優(yōu)勢；以F1金觀音的熒光定量表達(dá)量低于母本鐵觀音和父本黃旦的表達(dá)量稱為低于雙親表達(dá)量；以F1金觀音的熒光定量表達(dá)量介于母本鐵觀音和父本黃旦的表達(dá)量之間的稱為中親表達(dá)量；母本鐵觀音和父本黃旦的熒光定量表達(dá)量差別很大，以F1金觀音的表達(dá)量偏向雙親中表達(dá)量較高的一方稱為偏高親表達(dá)量，以F1金觀音的表達(dá)量偏向雙親中表達(dá)量較低的一方稱為偏低親表達(dá)量.比較參與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)基因熒光定量表達(dá)量的差異，分別將這三類差異基因以金觀音的表達(dá)量為參照進(jìn)行分組.

1.2.4 差異基因在黃觀音和金玫瑰中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 以黃觀音和金玫瑰的一芽二葉為材料，總RNA提取，熒光定量PCR模板、引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和數(shù)據(jù)結(jié)果定量分析與“1.2.2”的方法一致.

2 結(jié)果與分析

2.1 金觀音與其親本差異基因的分類

分別從金觀音—鐵觀音和金觀音—黃旦差減文庫中篩選出90和113條有效的單基因序列，其中，共有基因14個，76個差異基因的性狀遺傳黃旦，99個差異基因的性狀遺傳鐵觀音.在這兩個差減文庫中均篩選出參與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝等9類基因(表2).

表2 兩個差減文庫差異基因的個數(shù)Table 2 The number of differential genes between 2 suppression subtractive libraries

2.2 金觀音與其親本差異基因的表達(dá)量

從金觀音—鐵觀音和金觀音—黃旦差減文庫中篩選出的基因分別標(biāo)記為“TGY+序列號”和“HD+序列號”

2.2.1 金觀音與其親本參與生長發(fā)育類基因的表達(dá)模式 F1金觀音與其母本鐵觀音、父本黃旦參與生長發(fā)育類基因的表達(dá)模式分類如圖1所示.由圖1可知，此類基因有超高親(雜種優(yōu)勢)、低于雙親、中親、偏高親和偏低親5種表達(dá)模式.屬于超高親(雜種優(yōu)勢)表達(dá)量的基因有15個，分別為TGY5、TGY15、TGY189、TGY203、TGY206、TGY239、TGY253、TGY283、TGY454、TGY468、HD123、HD307、HD318、HD380、HD384；屬于低于雙親表達(dá)量的基因有5個，分別為TGY145、TGY160、TGY497、HD80、HD292；屬于中親表達(dá)量的基因有2個，分別為TGY186、TGY327；屬于偏高親表達(dá)量的基因有4個，分別為TGY159、HD152、HD229、HD266；屬于偏低親表達(dá)量的基因有4個，分別為TGY93、TGY345、HD73、HD473.

圖1 金觀音與其親本參與三類差異基因的表達(dá)模式Fig.1 Expression patterns for 3 kinds of differential genes between Jinguanyin and its parents

2.2.2 金觀音與其親本參與逆境脅迫類基因的表達(dá)模式 F1金觀音與其母本鐵觀音、父本黃旦參與抗性類基因的表達(dá)模式分類見圖1.由圖1可知，此類基因有超高親(雜種優(yōu)勢)、低于雙親和中親3種表達(dá)模式.屬于超高親(雜種優(yōu)勢)表達(dá)量的基因有10個，分別為TGY23、TGY117、TGY297、TGY494、HD15、HD86、HD122、HD331、HD451、HD467；屬于低于雙親表達(dá)量的基因有5個，分別為TGY145、TGY300、HD402、HD409、HD472；屬于中親表達(dá)量的基因有2個，分別為TGY304、TGY421.

2.2.3 金觀音與其親本參與次生代謝類基因的表達(dá)模式 F1金觀音與其母本鐵觀音、父本黃旦參與品質(zhì)類基因的表達(dá)模式分類見圖1.由圖1可知，此類基因有超高親(雜種優(yōu)勢)、低于雙親、中親和偏低親4種表達(dá)模式.屬于超高親(雜種優(yōu)勢)表達(dá)量的基因有4個，分別為TGY23、HD277、TGY482、HD27(前兩個基因與花青素苷合成相關(guān)，后兩個基因與香氣代謝相關(guān))；屬于低于雙親表達(dá)量的基因有6個，分別為TGY139、TGY147、HD32、HD136、HD342、TGY149(前5個基因與花青素苷合成相關(guān)，最后一個基因與香氣代謝相關(guān))；屬于中親表達(dá)量的基因有1個，為HD402(與花青素苷合成相關(guān))；屬于偏低親表達(dá)量的基因有1個，為HD512(與香氣代謝相關(guān)).

2.3 差異基因在親本與其3個F1品種的表達(dá)量

從超高親和低于雙親兩組表達(dá)模式中隨機(jī)篩選12個基因(表1)進(jìn)行熒光定量PCR分析，根據(jù)金觀音、黃觀音和金玫瑰3個F1品種與其父母本的表達(dá)量差異，又可分為3種類型，一是TGY15、TGY283(生長發(fā)育類基因)、HD451(逆境脅迫類基因)和HD27(香氣代謝類基因)，在3個F1品種上的表達(dá)量均超過雙親(圖2)，即存在雜種優(yōu)勢；二是TGY160(生長發(fā)育類基因)、TGY147、HD136和HD342(花青素苷合成類基因)，在3個F1品種上的表達(dá)量均低于雙親(圖3)，即存在雜種劣勢；三是TGY145、HD292(生長發(fā)育類基因)、TGY149(香氣代謝類基因)和HD277(花青素苷合成類基因)，在3個F1品種上的表達(dá)量部分超過雙親，部分低于雙親(圖4)，即雜種優(yōu)勢和雜種劣勢共同存在.

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).圖2 雜種優(yōu)勢基因的表達(dá)量Fig.2 The expression of heterosis genes

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).圖3 雜種劣勢基因的表達(dá)量Fig.3 The expression of hybrid weakness genes

3 討論

從金觀音—鐵觀音和金觀音—黃旦兩個差減文庫中篩選出的遺傳差異基因，其中一部分基因?qū)儆趦蓚€差減文庫共有的，表明這部分基因由親本共同遺傳給后代的；另一部分基因則是遺傳鐵觀音或黃旦，遺傳鐵觀音的差異基因總數(shù)多于遺傳黃旦的，表明金觀音的遺傳性狀多數(shù)趨向母本，屬于偏母本融合型雜種[10].

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).圖4 兼具雜種優(yōu)、劣勢基因的表達(dá)量Fig.4 The expression of genes with features of both heterosis and hybrid weakness

與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)的基因在F1金觀音及其母本鐵觀音、父本黃旦中均有表達(dá)，但實(shí)生后代發(fā)生大幅度的變異，依據(jù)表達(dá)量上的差異可分為超高親、低于雙親、中親、偏高親和偏低親5種表達(dá)模式.其中，中親表達(dá)所占比例很低，但這也反映出實(shí)生后代趨中變異的一個現(xiàn)象，即后代群體的平均水平常有返回某一中數(shù)的傾向[11].除中親表達(dá)屬于加性表達(dá)外，其余4種表達(dá)也稱作非加性表達(dá)[12]，這與Li et al[13]提出的關(guān)于雙親中不同表達(dá)量的基因比相同表達(dá)量的基因更易呈現(xiàn)非加性表達(dá)模式的觀點(diǎn)相近.

茶樹芽葉成熟期的早晚、芽葉色澤、抗逆性和香氣等屬于數(shù)量性狀.與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)的基因在F1金觀音中的表達(dá)量有的介于兩親本之間，有的超過雙親，有的則小于雙親的平均值，F(xiàn)1金觀音表現(xiàn)出的變異現(xiàn)象符合數(shù)量性狀的表型特點(diǎn).郭吉春等[4]研究認(rèn)為，金觀音和黃旦屬于早生種，鐵觀音屬于晚生種，但本試驗(yàn)中參與生長發(fā)育基因(如TGY160、HD292等)的表達(dá)量并不都是金觀音與黃旦相近且高于鐵觀音；鐵觀音幼嫩芽葉呈紫紅色，黃旦和金觀音幼嫩芽葉呈黃綠色[14]，因此從兩親本與F1兩個差減文庫中篩選出的直接編碼花青素苷合成途徑的酶類(如TGY23、HD342等)可能來源于試驗(yàn)取樣葉片紫紅色與非紫紅色的差異.研究表明，茶樹幼嫩芽葉的紫化現(xiàn)象與葉片中花青素的積累密切相關(guān)[15].但本試驗(yàn)中參與花青素苷合成基因(如TGY147、HD277等)的表達(dá)量并不都是金觀音與鐵觀音相近且高于黃旦；金觀音的抗性和香氣成分(如乙酸乙酯、α-萜品醇、水楊酸甲酯、香葉醇、茉莉內(nèi)酯等)超過鐵觀音和黃旦[16]，雜種優(yōu)勢強(qiáng)，但本試驗(yàn)中參與抗性和香氣代謝基因(如TGY145、TGY149等)的表達(dá)量并不都是金觀音高于雙親.上述前人的研究結(jié)果與本試驗(yàn)參與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)的基因在金觀音及其親本中表達(dá)趨勢的結(jié)果不完全一致，表明F1和親本中基因表達(dá)的差異既有可能受順式作用元件、反式作用元件或二者共同作用的影響，也有可能與它們的基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳機(jī)制、數(shù)量性狀基因位點(diǎn)有關(guān)[17].

本試驗(yàn)篩選出的超高親基因包括與生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝相關(guān)的基因，表明F1金觀音具有多方面的優(yōu)勢表現(xiàn).但金觀音雜種優(yōu)勢表現(xiàn)的程度不同，其優(yōu)勢有強(qiáng)有弱，這可能是環(huán)境因子與基因相互作用的結(jié)果[18].鐵觀音與黃旦雜交產(chǎn)生的其他F1黃觀音和金玫瑰有的均存在雜種優(yōu)勢，可能來源于鐵觀音與黃旦大量優(yōu)異等位基因的聚合，符合超顯性假說的觀點(diǎn)[19]；有的并非都存在雜種優(yōu)勢，可能由于雜種一代與親本之間的組織生長和發(fā)育過程呈動態(tài)變化，在供試樣品取樣時(shí)難以達(dá)到完全統(tǒng)一的生長勢標(biāo)準(zhǔn)，因此出現(xiàn)基因表達(dá)差異.就生育期、抗逆性、芽葉顏色和香氣等性狀而言，每一性狀受多少對基因的支配很難估計(jì)，這就涉及到數(shù)量性狀與雜種優(yōu)勢的關(guān)系，推測生育期、抗性和品質(zhì)等數(shù)量性狀是從微效多基因控制過渡到主基因—多基因混合控制形成茶樹雜種優(yōu)勢[20].鐵觀音與黃旦雜種一代表達(dá)水平上的多態(tài)性決定了研究茶樹雜種優(yōu)勢機(jī)理的復(fù)雜性.3個F1品種基因表達(dá)之間的差異與它們不同性狀的關(guān)系以及某個功能基因具體是哪種表達(dá)模式還需進(jìn)一步探討.

鐵觀音和黃旦作為重要的烏龍茶育種材料，通過雜交選育了一批優(yōu)良的茶樹品種，豐富了烏龍茶品種資源，對烏龍茶的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響.但鐵觀音與黃旦雜交后基因的遺傳規(guī)律復(fù)雜，還有待深入研究.因此，對親子代間的差異基因進(jìn)行表達(dá)分析，了解雜種和親本的遺傳趨勢，對雜種的早期選擇、雜種優(yōu)勢形成理論的解析具有理論和實(shí)踐價(jià)值.