不同嚴(yán)重程度變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的制備*

熊亞軍,金日群,彭韶平

(贛南醫(yī)學(xué)院1.2016級碩士研究生；2.第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江西 贛州 341000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)作為一種危害人類健康和生活質(zhì)量的全球性問題，已影響世界人口總數(shù)的10%～40%，且有逐年增加的趨勢[1]。到目前為止，AR仍不能被完全治愈，根本原因在于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，包括遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素等。為了進(jìn)一步深入了解AR的發(fā)病機(jī)制，尋找更好的治療方案，國內(nèi)外科研工作者們對于AR的研究從未停歇。但是，由于受到研究對象的限制，很多研究不能直接在人體內(nèi)進(jìn)行，所以動(dòng)物模型的制備就成了研究AR的一種必不可少的手段。

AR的臨床分類方法有很多種，包括按變應(yīng)原的類別、癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、疾病的嚴(yán)重程度[2]等，而目前尚缺乏不同嚴(yán)重程度的AR動(dòng)物模型的制備，因此，我們在基礎(chǔ)致敏后，通過延長鼻部激發(fā)的時(shí)間來探索不同嚴(yán)重程度AR動(dòng)物模型的制備?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組BALB/c小鼠32只，6～8周齡，雄性，清潔級，體重16～20 g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(贛)2018-0004]。將32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別記為A組(對照組)、B組(模型組Ⅰ)、C組(模型組Ⅱ)和D組(模型組Ⅲ)。

1.2主要試劑與藥品卵清蛋白(美國Sigma，A5503)，氫氧化鋁粉末(國藥，AR20001060)，乙二胺四乙酸二鈉(北京索萊寶，E8030)，小鼠卵清蛋白sIgE ELISA檢測試劑盒(上海江萊科技，JL20466)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶，G1120)。

1.3主要儀器多功能酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher Varioskan LUX)，倒置熒光顯微鏡(德國LEICA DMi8)，組織包埋機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠，YD-6D)，冷凍臺(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠，YD-6L)，三孔電熱恒溫水槽(上海一恒，DK-8D)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法將含有50 μg卵清蛋白和2 mg氫氧化鋁佐劑的生理鹽水懸濁液200 μL，于第1、8、15天行腹腔注射致敏共3次，間隔7天后，于第22天開始用5%的卵清蛋白生理鹽水溶液連續(xù)鼻部激發(fā)7天(B組)，14天(C組)和21天(D組)，每天1次，每次每側(cè)鼻腔各10 μL。對照組(A組)腹腔致敏與鼻部激發(fā)均使用生理鹽水進(jìn)行。

1.5標(biāo)本和數(shù)據(jù)采集每組小鼠在最后一次鼻部激發(fā)后，由實(shí)驗(yàn)外不知情人員對各組的行為表現(xiàn)(撓鼻、流涕、噴嚏)進(jìn)行觀察5 min，并做好記錄(積分>5表示造模成功，行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)見表1)。末次激發(fā)24 h后處死小鼠取材：摘眼球取血用于血清卵清蛋白sIgE的ELISA檢測；剪下整個(gè)鼻部于4%多聚甲醛溶液固定24 h后，10%EDTA脫鈣液內(nèi)脫鈣2周，每兩天更換脫鈣液1次，用于后續(xù)的組織形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)評分模型組和對照組比較，模型組的行為學(xué)評分均較對照組明顯升高(P<0.05)；模型組間比較，隨著鼻部激發(fā)時(shí)間的延長，行為學(xué)評分逐漸增高(P<0.05)(見表2)。

表1 小鼠行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 4組小鼠變應(yīng)性鼻炎行為學(xué)評分的比較

注：與A組比較，*P<0.001；與B組比較，#P<0.001；與C組比較，△P<0.05。

2.2鼻粘膜組織形態(tài)學(xué)蘇木素伊紅(HE)染色病理切片顯示，模型組鼻粘膜增生，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，基底細(xì)胞排列紊亂甚至破壞，毛細(xì)血管擴(kuò)張，腺體增生，固有層水腫，并可見大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。對照組鼻粘膜上皮完整，基底細(xì)胞正常，未見腫脹，無毛細(xì)血管擴(kuò)張，無腺體增生，無或少許炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1)。

2.3血清卵清蛋白sIgE 模型組和對照組比較，模型組的血清卵清蛋白sIgE含量明顯高于對照組(P<0.05)；模型組間比較，鼻部激發(fā)時(shí)間越長，血清卵清蛋白sIgE含量越高(P<0.05)(見表3)。

表3 4組小鼠血清卵清蛋白sIgE含量的比較

注：與A組比較，*P<0.001；與B組比較，#P<0.01；與C組比較，△P<0.001。

A.(對照組)上皮完整，粘膜下少量炎癥細(xì)胞浸潤，無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；B.(模型組Ⅰ)上皮不完整，鼻粘膜增生，粘膜下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；C.(模型組Ⅱ)鼻粘膜增生，基底細(xì)胞排列紊亂，粘膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張，腺體增生，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；D.(模型組Ⅲ)上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，基底膜破壞，固有層水腫，并見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。黃色箭頭表示嗜酸性粒細(xì)胞。

圖1小鼠鼻粘膜切片(HE染色)

3 討 論

由于受到多種因素限制， AR的許多研究并不能直接在人體內(nèi)進(jìn)行，因此尋找最接近人類發(fā)病過程和機(jī)理的動(dòng)物模型是我們深入了解AR的必經(jīng)之路。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的AR動(dòng)物模型，根據(jù)致敏原、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、致敏方法等的不同而存在有多種制備方式。致敏原包括甲苯二異氰酸酯、卵清蛋白、豚草花粉等，目前最常用到的是卵清蛋白；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括豚鼠、大鼠、小鼠、新西蘭兔等，其中豚鼠是最早用于建立AR模型的動(dòng)物，而現(xiàn)在最常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇是小鼠，因?yàn)橄啾葎e的造模動(dòng)物而言，小鼠對外來刺激敏感、繁殖能力強(qiáng)、基因組繪制已完成且與人類基因有著較高的同源性，同時(shí)由于基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，基因敲除小鼠已成為研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的重要對象[3-5]。雖然，目前對于AR動(dòng)物模型的建立總的來說已比較成熟，但是仍未達(dá)成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且還存在有許多需要繼續(xù)完善的方面，而對于不同嚴(yán)重程度AR動(dòng)物模型的建立就是其中之一。

AR作為一種特異性個(gè)體接觸變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的介質(zhì)釋放，并有多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的變態(tài)反應(yīng)性疾病[6-7]，其往往根據(jù)接觸變應(yīng)原的頻次、時(shí)間等的不同而表現(xiàn)出不同的癥狀。當(dāng)變應(yīng)原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，與sIgE結(jié)合引起肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放多種炎癥因子，這些炎癥因子與鼻粘膜作用后，可引起鼻癢、流清涕、打噴嚏和鼻塞等癥狀，另外，肥大細(xì)胞還可持續(xù)釋放活性遞質(zhì)，促使Th2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等向鼻粘膜組織遷移，造成鼻粘膜組織形態(tài)學(xué)上的改變[8-9]。臨床上常按照AR癥狀的嚴(yán)重程度不同，將其分為輕度和中-重度[2,10-11]。并且由于嚴(yán)重程度的不同，AR患者的治療方案選擇也往往存在差異。我們通過延長變應(yīng)原鼻部激發(fā)時(shí)間，模擬人類AR患者長期反復(fù)接觸變應(yīng)原的過程，建立不同嚴(yán)重程度的AR模型，然后通過造模后的癥狀表現(xiàn)、鼻粘膜的組織形態(tài)學(xué)改變和血清sIgE水平來評價(jià)是否成功。其中sIgE作為AR發(fā)病機(jī)制中的一種關(guān)鍵分子，其水平的高低不僅能夠診斷AR，而且還能反映AR的嚴(yán)重程度[5,12-14]。

本研究結(jié)果顯示，用卵清蛋白致敏并激發(fā)后，模型組小鼠的行為學(xué)評分、血清卵清蛋白sIgE的含量均較對照組明顯增加(P<0.05)，同時(shí)，不同鼻部激發(fā)時(shí)間的模型組之間的行為學(xué)評分、血清卵清蛋白sIgE的含量也存在差異，激發(fā)時(shí)間越長的組值越高(P<0.05)，另外，隨著激發(fā)時(shí)間的延長，小鼠鼻粘膜組織形態(tài)學(xué)改變也越明顯。以上結(jié)果表明，通過延長鼻部激發(fā)的時(shí)間，可以增加AR模型小鼠的嚴(yán)重程度。

綜上，通過延長鼻部激發(fā)時(shí)間，可以建立不同嚴(yán)重程度的AR模型，但是本研究也存在一些不足之處：①本次實(shí)驗(yàn)以生理鹽水鼻部激發(fā)7天作為對照組，未設(shè)定鼻部激發(fā)14天和21天的對照組；②僅延長激發(fā)期，而未做延長致敏期的對比實(shí)驗(yàn)等，所以我們?nèi)孕枥^續(xù)努力完善AR動(dòng)物模型的建立和機(jī)制的研究，為臨床上預(yù)防和治療AR打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。