用13C脈沖標(biāo)記法研究互花米草光合碳的分配

冉珊珊 ，時(shí)宇 ，黃黃 ，陳為祥 ，劉金娥 *，蘇海蓉，徐杰

1. 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院/江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省水土環(huán)境生態(tài)修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

互花米草（Spartina alterniflora）是多年生C4草本植物，原產(chǎn)于美國大西洋沿岸，1979年引入中國沿海并迅速擴(kuò)展。中國海岸帶互花米草植被的覆蓋面積已達(dá)到34451 hm2，其中以江蘇海濱濕地的現(xiàn)有面積最大，達(dá)18711 hm2（左平等，2009）。光合碳是“大氣-植物-土壤”系統(tǒng)碳循環(huán)的重要組成部分，與大氣環(huán)境、土壤質(zhì)量變化關(guān)系密切（周廣勝等，2003；尹云鋒等，2010）。植物光合作用是陸地和大氣間碳循環(huán)的驅(qū)動(dòng)力，是土壤有機(jī)碳的重要來源?；セ撞菅杆贁U(kuò)張使江蘇鹽城濕地土著種面積不斷減小，對(duì)鹽沼土壤碳的輸入輸出及循環(huán)產(chǎn)生顯著影響，因此研究互花米草生長(zhǎng)光合碳的分配與固定，對(duì)濕地碳平衡具有重要意義。

穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)是研究光合碳固定、分配及轉(zhuǎn)移的重要手段，具有安全、穩(wěn)定、易操作等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用在生物地球化學(xué)過程的研究中（馮建祥等，2013），國內(nèi)用13C脈沖法研究植物光合碳的分配主要集中在玉米（何敏毅等，2008）、水稻和小麥（齊鑫等，2008）等作物，但關(guān)于互花米草光合碳的分配鮮有研究。本研究利用13C脈沖標(biāo)記法示蹤互花米草光合碳在互花米草-土壤系統(tǒng)中的分配和去向，為科學(xué)評(píng)價(jià)外來入侵物種互花米草光合碳的分配提供參考，為研究互花米草對(duì)濕地碳源與匯的影響提供依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 互花米草室內(nèi)栽培

于2015年4月采集鹽城濕地表層0－20 cm土壤以及互花米草幼苗植株，將互花米草幼苗植株移栽至PVC管（直徑10 cm，高35 cm）中，2015年4－9月進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)。土壤有機(jī)碳7.00 g·kg-1，全氮 1.70 g·kg-1，總磷 0.31 g·kg-1，每盆裝風(fēng)干土約5 kg，種植互花米草1株，共種植30盆，其中15盆互花米草用13C脈沖標(biāo)記，另外15盆不做標(biāo)記處理。

1.2 互花米草13C脈沖標(biāo)記

標(biāo)記處理在特制的有機(jī)玻璃箱（長(zhǎng)×寬×高 1.5 m×0.9 m×1.2 m）內(nèi)進(jìn)行，每隔30 d向玻璃箱中通入NaH13CO3與 HCl溶液反應(yīng)產(chǎn)生的13CO2氣體（NaH13CO3+HCl=NaCl+H2O+13CO2，99 atom%13C），每次NaH13CO3的用量為10 g，共進(jìn)行4次標(biāo)記。標(biāo)記一般在8:00－12:00且晴朗的天氣進(jìn)行，在標(biāo)記過程中，箱內(nèi)溫度控制在28.5－37.6 ℃之間，加入適量冰塊防止箱內(nèi)溫度過高。在箱內(nèi)頂部安裝兩個(gè)小型風(fēng)扇保證箱內(nèi)氣體混合均勻。標(biāo)記步驟：（1）標(biāo)記前將栽植互花米草的 PVC盆放入標(biāo)記箱的底座上，在底座里加入適量冰塊，并放置4個(gè)250 mL燒杯，其中兩個(gè)放置NaH13CO3各5 g，另外兩個(gè)放置NaH12CO3各5 g；（2）將有機(jī)玻璃箱放在底座槽內(nèi)，向底座槽內(nèi)注滿自來水密封，開啟風(fēng)扇讓互花米草先光合作用15 min（也有研究者用堿液吸收法將空氣中CO2吸收掉），使互花米草處于饑餓狀態(tài)，提高互花米草13CO2的吸收；（3）標(biāo)記時(shí)先用黑布遮住有機(jī)玻璃箱，用醫(yī)用塑料滴管迅速向裝有NaH13CO3的燒杯中注入250 mL 2 mol·L-1的HCl溶液，待反應(yīng)5 min后，將黑布移開，讓互花米草在有機(jī)玻璃箱內(nèi)進(jìn)行光合作用；（4）待標(biāo)記45 min后，重復(fù)步驟（3）繼續(xù)向裝有NaH13CO3的另一個(gè)燒杯中注入HCl溶液使其產(chǎn)生13CO2氣體，最后2次，向裝有NaH12CO3的燒杯注入HCl溶液使其產(chǎn)生12CO2，以達(dá)到較好的標(biāo)記效果。在2015年6－9月每月對(duì)互花米草進(jìn)行1次脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行4次。

1.3 樣品采集與分析

在每次標(biāo)記后的第10天隨機(jī)選擇未標(biāo)記（CK）和標(biāo)記（BJ）的互花米草各3盆，進(jìn)行破壞性取樣，收獲互花米草的葉、莖、根、根際土壤以及 PVC管中土體?；セ撞萦谜麴s水洗凈后，放入烘箱內(nèi)于60 ℃下烘干至恒重，磨碎備用。根際土壤以及土體挑出貝殼、植物根系后自然風(fēng)干，磨碎，過孔徑0.150 mm篩備用。

互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體的全碳含量、13C自然豐度用同位素質(zhì)譜儀（Sercon intergra CN）測(cè)定。

1.4 指標(biāo)計(jì)算方法

（1）土壤或植物的13C自然豐度用δ13C值表示，公式如下（劉萍等，2015）：

式中，Rsample是樣品13C值和12C值的比值；RPDB是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)13C值和12C值的比值，是一個(gè)定值，為0.0112372。

標(biāo)記過土壤或植物一般用同位素豐度F（%）表示，δ13C與F可以相互轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換公式如下（Lu et al.，2003；齊鑫等，2008）：

（2）互花米草各組分固定13C量計(jì)算公式如下（安婷婷等，2013）：

本文提供的統(tǒng)一身份認(rèn)證解決方案能夠幫助簡(jiǎn)化應(yīng)用系統(tǒng)用戶創(chuàng)建及變更的流程，保持應(yīng)用系統(tǒng)中用戶數(shù)據(jù)與權(quán)威數(shù)據(jù)源的一致性，確保用戶基礎(chǔ)信息的準(zhǔn)確性，提高整體安全性和企業(yè)系統(tǒng)的集成度，同時(shí)簡(jiǎn)化用戶操作，改善用戶體驗(yàn)度，避免用戶記憶多套賬號(hào)信息，為用戶提供一站式、個(gè)性化、全面的服務(wù)。

式中，mCi為各組分碳量；Fm為標(biāo)記互花米草組分13C豐度；Fum為未標(biāo)記互花米草組分13C豐度。

各組分13C分配比例P13Ci（%）（安婷婷等，2013）：

式中，m13Ci,ft為互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體固定13C量的總和。

標(biāo)記效率Em（13C固定百分比）：

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，ArcGIS 9.3和OriginPro 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草不同器官13C豐度的動(dòng)態(tài)變化

未標(biāo)記（CK）互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體的13C豐度在4次標(biāo)記后差異不顯著，其中根、莖、葉13C豐度在1.1443%－1.1573%之間，根際土壤以及土體的13C豐度在 1.1121%－1.1125%之間（圖1a）。未標(biāo)記的互花米草13C豐度呈現(xiàn)由地上部分向地下部分遞減的規(guī)律，其中土體13C豐度波動(dòng)較小，比較穩(wěn)定。在4次同位素脈沖標(biāo)記后，與未標(biāo)記組相比，標(biāo)記后（BJ）互花米草各組分以及土壤的13C豐度值都呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)（圖1b），但根際土壤、土體相對(duì)植物根、莖、葉變化不明顯，較穩(wěn)定?；セ撞菰诮?jīng)過第4次標(biāo)記后的第10天收獲，收獲后測(cè)定的互花米草根、莖、葉 δ13C 值分別為 397.23‰、721.77‰、606.07‰、69.4‰和29.4‰，根際土壤δ13C值也高達(dá)29.4‰，明顯發(fā)生了富集。

圖1 互花米草-土壤系統(tǒng)13C豐度值Fig. 1 Abundance value(F) of 13C in S. alterniflora-soil system

2.2 凈光合13C在植物-土壤中的分配

2.2.1 互花米草-土壤系統(tǒng)中各組分固定13C量

在每次標(biāo)記結(jié)束后取樣，測(cè)定葉、莖、根和土壤中的13C含量，計(jì)算其固定13C量以及在各部分的分配比例。4次標(biāo)記各器官總共固定的13C量分別為 52.80、125.20、217.11和 276.81 mg·plant-1（以C計(jì)）。4次標(biāo)記后，互花米草各個(gè)器官（葉、莖、根）、根際土壤以及土體固定的13C量隨標(biāo)記次數(shù)增加而逐漸增加，固定13C量呈現(xiàn)莖、葉、根、根際土壤、土體逐漸減小的趨勢(shì)（表1）?；セ撞?土壤體系中，各組分固定的碳量隨著標(biāo)記次數(shù)增加而逐漸增加，但互花米草固定的13C主要集中在地上部分（莖、葉）。土體中碳含量逐漸增加，表明在供試土壤條件下，互花米草生長(zhǎng)促進(jìn)了土壤碳匯的作用。

2.2.213C在互花米草各部位及土壤中的分配比列

各組分固定13C占凈光合13C的比例稱為該組分13C的分配比例。4次標(biāo)記后，葉、莖、根、根際土壤以及土體各組分固定13C量占凈光合13C總量分配比例按莖、葉、根、根際土壤、土體依序逐漸減少（圖2）?；セ撞萑~固定13C量分配比例在32.48%－39.20%之間；莖固定13C量分配比例在39.83%－47.65%之間；根固定13C量分配比例在18.01%－20.34%之間；根際土壤固定13C量分配比例較穩(wěn)定，波動(dòng)較小，隨標(biāo)記次數(shù)增加呈先增加后下降再上升的規(guī)律，分配比例在 0.30%－0.42%之間；土體固定的13C量占凈光合碳的比重較小，隨標(biāo)記次數(shù)增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，分配比例在0.08%－0.20%之間。光合作用固定13C在地上部分（莖、葉）的分配比例在 75.36%－81.13%之間，地下部分（根、根際土壤、土體）的分配比例在 18.51%－24.63%之間。地上部分固定的13C顯著高于地下部分。

圖2 13C在互花米草-土壤系統(tǒng)各組分中的分配比例Fig. 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C in S.alterniflora-soil system

表1 不同標(biāo)記次數(shù)后凈光合固定13C的量Table 1 Net photosynthesized 13C distribution in each part of S. alterniflora-soil system

2.3 13C脈沖標(biāo)記互花米草-土壤系統(tǒng)中的標(biāo)記效率

13C的標(biāo)記效率是指互花米草-土壤系統(tǒng)中各組分固定13C的量與標(biāo)記時(shí)輸入系統(tǒng)中13C的量的百分比。根據(jù)互花米草莖、葉、根、根際土壤和土體的13C豐度以及標(biāo)記時(shí)輸入系統(tǒng)中13C量，可以計(jì)算13C的標(biāo)記效率。根據(jù)加入的標(biāo)記物，計(jì)算出每次標(biāo)記時(shí)輸入的13C量為1.51 g。4次標(biāo)記后的標(biāo)記效率在 3.47%－4.77%之間，標(biāo)記效率隨標(biāo)記次數(shù)增加而先增加后降低（圖3）。尹云鋒等（2010）通過 5次脈沖標(biāo)記使水稻的標(biāo)記效率為 35%，與Rees et al.（2005）研究的小麥的標(biāo)記效率大致一致，但本研究標(biāo)記效率在 3.47%－4.77%，與前人研究相比，相對(duì)較低。

圖3 互花米草標(biāo)記效率Fig. 3 Fixed proportion of 13C in S. alterniflora-soil system

3 討論

3.1 互花米草-土壤系統(tǒng)中13C富集程度

穩(wěn)定碳同位素技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，13C標(biāo)記法與14C標(biāo)記法相比，具有無放射性、較安全、標(biāo)記均勻等優(yōu)點(diǎn)（尹云鋒等，2007）。隨著穩(wěn)定碳同位素測(cè)定技術(shù)的改進(jìn)和提高，利用穩(wěn)定碳同位素變化研究各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期植物光合產(chǎn)物的去向，植物的秸稈、殘茬或根系在土壤中的分解動(dòng)態(tài)變化和在土壤有機(jī)碳不同組分中的分配，已經(jīng)成為一個(gè)重要的方法和手段（Dmjs et al.，2002）。

13C標(biāo)記可分為連續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記，本文采用脈沖標(biāo)記法，在植物生長(zhǎng)的各個(gè)生育期均提供標(biāo)記以提高標(biāo)記效率。本研究中，經(jīng)過4次13C標(biāo)記后，互花米草各個(gè)器官（葉、莖和根）、根際土壤以及土體的 δ13C值分別為 606.07‰、721.77‰、397.23‰、69.4‰和 29.4‰，這說明本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記可以獲得較滿意的富集13C互花米草材料。這與Lu et al.（2003）的研究一致。Simard et al.（1997）也發(fā)現(xiàn)白樺（Betula platyphylla）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）脈沖標(biāo)記半小時(shí)后，其葉子13C值明顯發(fā)生富集，分別達(dá)到660‰、460‰，與本文研究一致。4次標(biāo)記后，互花米草13C豐度變化表現(xiàn)為莖＞葉＞根＞根際土壤＞土體。安婷婷等（2013）標(biāo)記玉米1 d后，同一處理組13C豐度變化表現(xiàn)為莖葉＞根＞根際土壤＞土體（劉萍等，2015）；Butler et al.（2004）在苗期對(duì)黑麥草進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后1 d得出的結(jié)果同樣如此，均與本研究結(jié)論一致。Bromand et al.（2001）利用脈沖標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記 13次后收獲測(cè)得小麥器官的δ13C值為2140‰－2370‰，與本研究相差2－3倍。說明標(biāo)記后植物富集13C結(jié)果的差異與標(biāo)記次數(shù)、標(biāo)記時(shí)間（安婷婷等，2013）、植物類型及其生長(zhǎng)期不同有關(guān)。

3.2 互花米草-土壤系統(tǒng)中各組分固定13C量

有研究表明，土壤呼吸損失碳量占同化碳總量的40%以上（Kuzyakov et al.，2001），但需要在特定可控制的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行研究，本研究沒有考慮呼吸的作用?；セ撞莨潭?3C量主要指根、莖、葉、根際土壤和土體固定13C量之和。各組分固定13C量呈現(xiàn)莖、葉、根、根際土壤、土體依序遞減的趨勢(shì)，13C的分配比呈現(xiàn)同樣規(guī)律。盡管土體中13C變化趨勢(shì)不明顯，但也呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，這可能是光合固定的13C通過根系將根際沉積物輸入土壤，被土壤微生物吸收和利用，導(dǎo)致土體中值有所上升（馬真等，2016）。Wu et al.（2010）在矮嵩草（Kobresia humips）草甸上標(biāo)記32 d后發(fā)現(xiàn)31%左右的13C進(jìn)入地下活根中，F(xiàn)an et al.（2008）也研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記27 d后20%－40%的光合碳進(jìn)入到地下，這都與本研究一致。本研究中，光合作用固定的13C在地上部分（莖、葉）的分配比例在75.36%－81.13%之間，地下部分（根、根際土壤、土體）的分配比例在 18.51%－24.63%之間。與Kuzyakov et al.（2004）研究的小麥、牧草、玉米地上（莖、葉）和地下（根、土體、根際呼吸）部分光合碳的分配比例（表2）相比，互花米草地上部分分配比例相對(duì)較大，地下部分分配相對(duì)較小，這可能是因?yàn)楸狙芯炕セ撞菰谑覂?nèi)培養(yǎng)，受條件限制，互花米草地上部分生物量比較小，存在相對(duì)濃縮作用（喬云發(fā)等，2010），地下部分分配比例相對(duì)較小是因?yàn)楸狙芯恐形纯紤]土壤和互花米草的呼吸作用。加上小麥、牧草具有較大的植物根系，能固定更多的13C。其他研究者得出柳枝稷（Panicum virgatum）固定13C的比例在42%－79%之間（Chaudhary et al.，2012），蠶豆（Vicia faba）固定13C比例41%－67%（Fan et al.，2008）。

表2 不同植物光合13C的分配比例Table 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C of different plants

4 結(jié)論

未標(biāo)記組各組分的13C豐度在4次標(biāo)記后差異顯著；互花米草在4次穩(wěn)定碳同位素脈沖標(biāo)記后，植物根、莖、葉、根際土壤以及土體13C豐度值都有明顯上升趨勢(shì)。13C豐度隨標(biāo)記的次數(shù)而增加；4次標(biāo)記固定的13C量分別為52.80、125.20、217.11、276.81 mg·plant-1，各部分固定的13C量隨標(biāo)記次數(shù)增加而增加，而且地上部分固定13C量和分配比例都明顯大于地下部分。