球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇的兩階段pH值調(diào)控

顧麗娜，李良智，郭偉強，康 培，胡翠英，扶教龍

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

赤蘚糖醇（1，2，3，4-丁四醇）是一種天然的四碳糖醇，它存在于自然界的一些蘑菇和水果中，同時酒、醬油等發(fā)酵類產(chǎn)品中也能檢測到赤蘚糖醇的存在[1]。在10%的質(zhì)量濃度下，赤蘚糖醇的甜度約為蔗糖的60%～80%[2]。另有研究表明，赤蘚糖醇的血糖指數(shù)和胰島素指數(shù)分別為0 和2，因而赤蘚糖醇的攝入幾乎不會造成血液中葡萄糖水平的上升[3]。此外，大多數(shù)糖醇類甜味劑的熱量值大約在2 cal·g-1，而赤蘚糖醇的熱量值只有0.2 cal·g-1[4]。同時，赤蘚糖醇還具有很高的人體耐受量，即使大量食用也不易引起腹瀉或腸胃脹氣[5]。由于很多口腔微生物無法利用赤蘚糖醇，食用赤蘚糖醇也不會造成齲齒[6]。因此，它是一種優(yōu)良的食品甜味劑。

據(jù)專利報道，球頭三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）可耐受20%～60%（w/v）的葡萄糖，是生產(chǎn)赤蘚糖醇的優(yōu)良菌株[7]。在前期關(guān)于滲透壓對球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇代謝影響的研究過程中發(fā)現(xiàn)：在初始pH值為5.5 的條件下，發(fā)酵36 h 后，發(fā)酵液的pH值會降至3.0 以下，這說明球頭三型孢菌在利用葡萄糖生產(chǎn)赤蘚糖醇的發(fā)酵前期，產(chǎn)生了大量的有機酸，造成發(fā)酵體系的pH值迅速下降。這種低pH值脅迫的持續(xù)進行會影響酵母質(zhì)膜所帶的電荷，引起細(xì)胞質(zhì)膜對部分離子的通透性發(fā)生變化，并最終影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、酶的合成、酶活性的發(fā)揮以及正常的代謝途徑。過低的pH值還會造成酵母蛋白變性，引起細(xì)胞死亡[8-9]。因此，在采用球頭三型孢菌以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的過程中，對發(fā)酵體系的pH值進行合理調(diào)控是十分必要的。進一步地，由于細(xì)胞在一個發(fā)酵周期內(nèi)的生理狀態(tài)有差別，其菌體生長和產(chǎn)物合成達到最優(yōu)值所需的pH值可能并不相同。事實上，已經(jīng)有很多研究著眼于探索發(fā)酵過程的分段pH值控制策略。例如，為了提高菌株產(chǎn)甘露醇的能力，岳敏等人[10]采取了兩階段pH值控制策略，即在發(fā)酵的前12 h 將pH值控制在5.5，之后將pH 降至4.5，最終得到了103 g·L-1的甘露醇產(chǎn)量。2013 年，江南大學(xué)的張顯等人[11]基于3-羥基丁酮還原酶/2，3-丁二醇脫氫酶對pH值的偏向性，提出了兩階段pH值控制策略，即在發(fā)酵的前48 h 將pH值控制在6.5，后48 h 則控制在8.0，最終在pH值控制策略的基礎(chǔ)上進行補料分批發(fā)酵，將3-羥基丁酮的產(chǎn)量提高到73.6 g·L-1。此外，浙江大學(xué)的研究人員在發(fā)酵的前48 h 將pH值控制在6.8 以促進細(xì)胞生長，然后將其調(diào)至5.8 以增強吡喹啉奎寧（PQQ）的生物合成。最終，PQQ 的產(chǎn)量提高到158.61 mg·L-1，比最適恒定pH值條件下的產(chǎn)量提高了44.9%[12]。針對球頭三型孢菌發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的pH值調(diào)控問題，目前國內(nèi)外還未有系統(tǒng)的研究。

筆者首先采用搖瓶發(fā)酵初步研究了pH 對球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇的影響，接著在5L發(fā)酵罐中進行pH 恒定為4.5、5.0、5.5、6.0 的比較發(fā)酵，根據(jù)球頭三型孢菌在不同pH 條件下的赤蘚糖醇產(chǎn)量、菌體生物量、葡萄糖消耗速率和赤蘚糖還原酶（ER）酶活等參數(shù)的變化規(guī)律，最終探索出適合該菌株生產(chǎn)赤蘚糖醇的pH值調(diào)控策略。

1 材料與方法

1.1 菌株

耐高滲酵母球頭三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalisATCC 16958）購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所。

1.2 實驗試劑

酵母粉和蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；NADPH 購自上海翊圣生物科技有限公司；赤蘚糖購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g·L-1，葡萄糖200 g·L-1，磷酸二氫鉀0.5 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，氯化鉀5 g·L-1。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng) 從4 ℃保存的斜面培養(yǎng)基上刮取一環(huán)菌接種到50 mL 種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 rpm的搖床條件下培養(yǎng)48 h。

1.4.3 5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)至指數(shù)中期的種子液以10%的接種量接種到5 L 發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的裝液量為3 L，通氣量控制在0.5～1 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速350 r·min-1，溫度30 ℃。

1.5 分析方法

1.5.1 赤蘚糖醇產(chǎn)量測定 高效液相色譜法(HPLC)：采用Agilent 1260 系統(tǒng)，NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，Shodex，Japan）色譜柱，ELSD（蒸發(fā)光散射檢測器）檢測器。樣品分析條件為：柱溫30 ℃，流動相為“乙腈-水（70∶30）”，流速0.7 mL·min-1。ELSD 的漂移管溫度設(shè)為35 ℃，氮氣流量為1.6 L·min-1，增益值為1。

1.5.2 生物量測定 通過測定細(xì)胞的干重來確定生物量濃度。發(fā)酵周期內(nèi)取出一定體積的發(fā)酵液，14 000 r·min-1離心20 min，去上清，將沉淀用去離子水清洗兩遍后，再次離心。小心丟棄上清液，將細(xì)胞沉淀物在80 ℃烘箱中干燥至恒定干重。

1.5.3 殘?zhí)菧y定 取發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用葡萄糖氧化酶膜生物分析儀（SBA 生物傳感分析儀）測定殘余葡萄糖量。

1.5.4 ER 酶活測定 使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，用二喹啉甲酸（BCA）測定法測定總蛋白濃度。ER 酶活測定方法參照文獻[13]進行，并作適當(dāng)調(diào)整。反應(yīng)緩沖體系為：50 mM 磷酸鹽緩沖液（pH=6.5），12 mM 赤蘚糖，0.2 mM NADPH。酶反應(yīng)溫度為37 ℃。37 ℃下1 min 催化1 μmol NADPH 氧化所需的酶量定義為一個酶活單位。比酶活用每毫克細(xì)胞蛋白的酶活性表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同初始pH值對球頭三型孢菌發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)整至4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0，接種后置于搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，120 h 后檢測發(fā)酵產(chǎn)物中赤蘚糖醇的含量。測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 數(shù)據(jù)表明，隨著pH值的增大赤蘚糖醇的產(chǎn)量不斷提高。pH=4.0 時，赤蘚糖醇產(chǎn)量僅為25.19 g·L-1，而當(dāng)pH值增大至6.0 時，赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高至45.79 g·L-1，是pH=4.0 時產(chǎn)量的1.82 倍。由此可見，pH值這一環(huán)境條件對于球頭三型孢菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的發(fā)酵過程影響很大，故采用合適的策略對發(fā)酵體系的pH值進行合理調(diào)控是十分重要的。

圖1 不同初始pH值對赤蘚糖醇合成的影響

2.2 5L發(fā)酵罐中恒定pH值發(fā)酵

在上述搖瓶實驗的基礎(chǔ)上，筆者在5 L 發(fā)酵罐中繼續(xù)進行恒定pH值（4.5、5.0、5.5 和6.0）的發(fā)酵研究，并在整個發(fā)酵周期內(nèi)，每隔12 h 取樣檢測赤蘚糖醇產(chǎn)量（如圖2所示）、菌體生物量（如圖3所示）和葡萄糖剩余量（如圖4所示）。

圖2 不同恒定pH值條件下球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇發(fā)酵曲線

圖3 不同恒定pH值條件下球頭三型孢菌生長曲線

圖2 數(shù)據(jù)顯示，隨著發(fā)酵體系中pH值的升高，赤蘚糖醇的產(chǎn)量不斷上升，在發(fā)酵120 h 后，pH=4.5、5.0、5.5、6.0 所對應(yīng)的赤蘚糖醇產(chǎn)量分別為31.39、36.02、38.23、46.75 g·L-1，其中pH=6.0 的最終赤蘚糖醇產(chǎn)量比pH=4.5提高了48.93%。圖3 中的菌體生物量數(shù)據(jù)表明，在pH值為4.5 和5.0 的條件下，菌體的生長速率要高于pH=5.5、6.0，且在這4 個pH值條件中，最適合球頭三型孢菌生長的pH值為5.0。pH=4.5、5.0 條件下，菌體生物量在發(fā)酵108 h 后達到最大值，分別為43.44 g·L-1和47.07 g·L-1，而在pH=5.5、6.0 環(huán)境下生長的菌體細(xì)胞，其最大生物量出現(xiàn)的時間為發(fā)酵120 h，分別為36.60、26.44 g·L-1。特別地，在發(fā)酵36 h 時，pH=4.5、5.0、5.5 和6.0 的菌體生物量分別為22.18、27.99、13.28、12.46 g·L-1，即此時pH=5.0 的菌體生物量分別為pH=4.5 的1.26 倍、pH=5.5 的2.11 倍、pH=6.0 的2.25 倍。圖4 的殘?zhí)菙?shù)據(jù)也同樣顯示，在發(fā)酵36 h 后，pH值為5.0 的發(fā)酵體系中葡萄糖消耗量最大，其中的葡萄糖濃度已經(jīng)降至100 g·L-1?？傮w來看，pH=6.0 的耗糖量在發(fā)酵中后期低于其他pH值條件，這可能是由于菌體生物量太低造成的。

大學(xué)學(xué)習(xí)自由度大，學(xué)習(xí)的自主性和廣泛性特點顯著。大學(xué)要求大學(xué)生必須對自身的學(xué)習(xí)負(fù)責(zé)，課時數(shù)也有所減少。由于中學(xué)和大學(xué)教育銜接不通暢，大學(xué)生入學(xué)后容易出現(xiàn)焦慮迷茫期，導(dǎo)致學(xué)期動力減退，心理相對脆弱，學(xué)習(xí)成績不合格率升高（金國雄等，2003）。大學(xué)商務(wù)英語課程通常采取班級授課制，班級學(xué)生英語水平和英語學(xué)習(xí)態(tài)度不一，而由于他們自主學(xué)習(xí)能力不足，導(dǎo)致班級授課效果不高，班級分層越來越嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)有些學(xué)生完全放棄英語學(xué)習(xí)的情況。即使程度較好的班級，也更多的是由教師來主導(dǎo)課堂，學(xué)生被動接受。而這種英語學(xué)習(xí)方式并無法充分調(diào)動學(xué)生的主觀能動性，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)動力。

由于ER 催化赤蘚糖醇合成的最后一步，即以NADPH 為輔酶，催化赤蘚糖還原為赤蘚糖醇，因而被認(rèn)為是赤蘚糖醇合成過程中的關(guān)鍵酶[14-16]。為了更深層次地研究pH值對球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇的影響，筆者同時測定了細(xì)胞內(nèi)的ER 酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖4 不同恒定pH值條件球頭三型孢菌發(fā)酵殘?zhí)乔€

圖5 不同恒定pH值條件球頭三型孢菌細(xì)胞內(nèi)ER 酶活變化曲線

圖5 中的ER 酶活數(shù)據(jù)表明，隨著pH值的上升，球頭三型孢菌細(xì)胞內(nèi)的ER 活性也隨之增大。而且，pH=6.0 時的ER 酶活在整個發(fā)酵周期內(nèi)都大幅度地高于其他pH值條件。在發(fā)酵72 h 時，pH=6.0 條件下細(xì)胞內(nèi)ER 酶活為0.383 U·mg-1protein，分別為同時刻pH=4.5、5.0、5.5 的3.83 倍、2.70 倍、2.28 倍。因此，在所研究的4 個pH值條件中，保持發(fā)酵體系的pH值為6.0 可以在整個發(fā)酵周期內(nèi)大幅度提高ER 的活性，實現(xiàn)赤蘚糖醇的高效合成。

為了更簡潔直觀地分析適合球頭三型孢菌發(fā)酵生產(chǎn)的pH值條件，筆者對其在不同pH值條件下的最大菌體生物量和比生產(chǎn)速率進行了對比，結(jié)果見表1。表1 數(shù)據(jù)顯示，pH=5.0 條件下最大菌體生物量為47.07 g·L-1，是pH=6.0 的1.78 倍，然而赤蘚糖醇的比生產(chǎn)速率卻是隨pH值的上升而增大，尤其在pH=6.0 條件下，赤蘚糖醇的比生產(chǎn)速率可以達到0.015 g·（gh）-1，是pH=5.0 的2.14 倍。

表1 不同pH值條件下最大菌體生物量和赤蘚糖醇比生產(chǎn)速率對比

綜上，pH=5.0 較適合球頭三型孢菌生長，pH=6.0 則會大幅度地提升ER 酶活，有利于赤蘚糖醇合成。

2.3 球頭三型孢菌產(chǎn)赤蘚糖醇發(fā)酵過程分階段pH值調(diào)控

上述實驗結(jié)果反映出球頭三型孢菌細(xì)胞生長和發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇所需的最適pH值是不同的，因此，為了更進一步地提升赤蘚糖醇的產(chǎn)量，有必要對發(fā)酵過程的pH值進行分段調(diào)控。基于以上分析，筆者提出了一種兩階段pH 調(diào)控策略，即在發(fā)酵前期（0～36 h）控制pH=5.0，之后控制pH=6.0。發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。

72 h 之前，兩階段pH值調(diào)控與單一控制pH=5.0 對于葡萄糖的利用速率幾乎相同，但72 h 之后，兩階段pH值調(diào)控的耗糖量遠遠低于單一控制pH=5.0，84 h 時pH=5.0的殘?zhí)橇績H為6.85 g·L-1，而此時兩階段pH值調(diào)控的殘?zhí)橇繛?2 g·L-1，介于pH=5.0～6.0（殘?zhí)橇繛?4 g·L-1）之間，這說明兩階段pH值調(diào)控策略增大了發(fā)酵體系中葡萄糖的利用效率。采用兩階段pH值調(diào)控策略后，經(jīng)過120 h 的發(fā)酵，最終的菌體生物量為47.50 g·L-1，是單一控制pH=6.0的1.80 倍。此外，兩階段pH值調(diào)控發(fā)酵過程中，ER 的酶活在48 h 達到最大值0.55 U·mg-1protein，比單一pH值控制時的最大酶活 （pH=6.0，0.38 U·mg-1protein） 提高了44.74%。最終發(fā)酵產(chǎn)物中赤蘚糖醇的產(chǎn)量達到56.78 g·L-1，比單一控制pH值的最大產(chǎn)量（pH=6.0，46.75 g·L-1）提高了21.45%。

圖6 兩階段pH值調(diào)控策略下赤蘚糖醇合成時間曲線

3 結(jié)語

球頭三型孢菌發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)赤蘚糖醇的最適pH值不同，經(jīng)過初步探索，發(fā)現(xiàn)pH=5.0 最適合菌體的生長，而pH=6.0 則大幅度提升了ER 的酶活性，更有利于赤蘚糖醇的合成。因而提出了一種兩階段pH值調(diào)控策略：在發(fā)酵前期（0～36 h）控制pH=5.0，之后控制pH=6.0。在此策略下進行發(fā)酵，最大ER 酶活比單一pH值控制提高了44.74%。發(fā)酵120 h 后，赤蘚糖醇產(chǎn)量達到56.78 g·L-1，比單一控制pH值的最大產(chǎn)量（pH=6.0，46.75 g·L-1）提高了21.45%。