產(chǎn)ε-聚賴氨酸白色鏈霉菌的化學(xué)誘變育種

尤麗新，胡楠楠，班 碩

（1.長(zhǎng)春科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

隨著人們對(duì)食品安全意識(shí)的增強(qiáng)，食品天然防腐劑逐漸出現(xiàn)在大眾視野中，其包括植物源、動(dòng)物源、微生物源天然抗菌防腐劑三大類型。微生物發(fā)酵得到有抑菌作用的物質(zhì)稱為微生物源天然抗菌防腐劑。微生物源天然抗菌防腐劑相對(duì)于植物源、動(dòng)物源天然抗菌防腐劑具有數(shù)量大、成本低、周期短、抑菌譜廣、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。乳酸鏈球菌素、納他霉素及ε-聚賴氨酸為目前主要使用的微生物防腐劑[1]。其中ε-聚賴氨酸易溶于水、耐高溫、安全性高，可以抑制真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌以及某些病毒的生長(zhǎng)[2]。

化學(xué)合成的聚賴氨酸為α型[3]且具有毒性[4]，因此，目前普遍采用發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸通常是由白色鏈霉菌屬（Streptomyces albus）合成，然而經(jīng)過(guò)初步篩選得到的野生菌產(chǎn)ε-聚賴氨酸能力有限。為了提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的合成能力，對(duì)野生菌進(jìn)行一定的改造具有重要的意義。KAHAR P等[4]以亞硝基胍為誘變劑對(duì)白色鏈霉菌410進(jìn)行化學(xué)誘變，最終篩選出一株ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量為2.11 g/L的雙抗高產(chǎn)突變株，其產(chǎn)量是野生菌的10倍；陳瑋瑋等[5]使用化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯對(duì)北里孢菌（Kitasatospora）PL6-3進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選到一株ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量為1.2g/L的高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量是未誘變前的3倍；李雙雙等[6]采用物理誘變復(fù)合化學(xué)誘變對(duì)白色鏈霉菌8號(hào)菌株進(jìn)行誘變，篩選到一株ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量為0.73 g/L的突變菌株，其產(chǎn)量是未誘變前的2.2倍。近年來(lái)，還有一些研究團(tuán)隊(duì)使用新技術(shù)用于篩選ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌。LI S等[7]采用基因重排技術(shù)獲得了一株禾粟鏈霉菌（Streptomyces graminearus）F3-4，ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.5倍；ZONGH等[8]利用常壓等離子誘變小白鏈霉菌（Streptomyces albulus）A-29，ε-聚賴氨酸產(chǎn)量是未誘變前的3.8倍。

本試驗(yàn)以白色鏈霉菌BNCC186223為出發(fā)菌株，硫酸二乙酯為誘變劑，采用化學(xué)誘變法對(duì)其進(jìn)行誘變，考察最佳誘變條件，并篩選一株高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的菌株，為我國(guó)規(guī)模化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

白色鏈霉菌（Streptomyces albus）BNCC186223：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

甲基橙（分析純）：濟(jì)南蕭試化工有限公司；亞甲基藍(lán)（分析純）：無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；硫酸二乙酯（99.7%）：天津市富鑫商貿(mào)有限公司；ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）：重慶賽普那斯科技有限公司；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

鏈霉菌培養(yǎng)基2號(hào)（ISP-2）[9-10]：酵母膏4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，葡萄糖4.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH為7.0～7.4，121℃滅菌20 min。

貝特納培養(yǎng)基[11]：葡萄糖10 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，瓊脂18g，蒸餾水定容至1L，調(diào)pH至7.5，121℃滅菌20min。

初篩培養(yǎng)基（含亞甲基藍(lán)的貝特納培養(yǎng)基）[9-10，12]：葡萄糖10 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，瓊脂18 g，亞甲基藍(lán)0.05 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH至7.5，121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[12-13]：葡萄糖50g，酵母膏5g，（NH）42SO410 g，磷酸氫二鉀0.8 g，磷酸二氫鉀1.36 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO·47H2O 0.03 g，ZnSO·47H2O 0.04 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH至6.8，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；L5紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-70A高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體活化[14-15]

在無(wú)菌條件下，打開安瓿瓶，吸取0.5 mL無(wú)菌蒸餾水將菌粉溶解，取適量的孢子懸液接種至ISP-2斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)7 d。取活化后的斜面種子一環(huán)接種于貝特納斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3.2 誘變育種

單孢子菌懸液的制備[14，16]：待分離純化的斜面菌種孢子成熟鋪滿斜面，用生理鹽水洗下孢子，倒入裝有玻璃珠的三角瓶中振蕩，使孢子分散，用八層紗布過(guò)濾，得到單孢子懸液，采用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整孢子濃度至108CFU/mL[13]。

硫酸二乙酯誘變處理[14，17-18]：分別取硫酸二乙酯原液和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇等體積混合，加入5mL單孢子懸液，于200 r/min條件下振蕩處理，處理后立即添加等量的25%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，靜置10 min，10 000 r/min離心5 min，棄上清，采用pH6.9、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次，再加入10 mL磷酸鹽緩沖液于旋渦混合器上混勻。

稀釋涂布[17-18]：將誘變后的孢子懸液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4，選擇10-2、10-3、10-4稀釋孢子懸液分別涂布于貝特納培養(yǎng)基。以未經(jīng)硫酸二乙酯誘變的孢子稀釋液（孢子濃度為108CFU/mL）作對(duì)照，30℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

存活率和致死率[10]：對(duì)培養(yǎng)好的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以對(duì)照組平板菌落數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算經(jīng)硫酸二乙酯處理后每毫升菌液中的孢子存活率和致死率，計(jì)算公式如下：

1.3.3 高產(chǎn)ε-聚賴氨酸誘變菌株的初篩[17-19]

將誘變后的白色鏈霉菌孢子接種于含亞甲基藍(lán)的貝特納培養(yǎng)基，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d。亞甲基藍(lán)是一種堿性染料，當(dāng)微生物分泌產(chǎn)生帶正電產(chǎn)物時(shí)，由于靜電作用，將排斥亞甲基藍(lán)而形成獨(dú)特透明圈，菌落周圍藍(lán)色較淺。ε-聚賴氨酸是陽(yáng)離子表面活性物質(zhì)，含有氨基，在水中帶正電。根據(jù)ε-聚賴氨酸與菌株間的靜電作用使菌落周圍產(chǎn)生透明圈的原理，對(duì)高產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌的誘變菌株進(jìn)行初步篩選。計(jì)算透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的比值，即H/C值。一般H/C值越大，ε-聚賴氨酸產(chǎn)量越高；H/C值越小，則ε-聚賴氨酸產(chǎn)量越低。因此，根據(jù)H/C值作為篩選高產(chǎn)ε-聚賴氨酸誘變菌株的指標(biāo)。

1.3.4 高產(chǎn)ε-聚賴氨酸誘變菌株的復(fù)篩

分別將2 mL出發(fā)菌株BNCC186223與經(jīng)初篩的誘變菌株孢子（108CFU/mL）接種于裝有40 mL貝特納液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中[19]，30℃、200r/min條件下培養(yǎng)72h，以其作為種子液。

以6%（V/V）的接種量將種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中[19]，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h。測(cè)定發(fā)酵液中的生物堿物質(zhì)及ε-聚賴氨酸含量。

1.3.5 生物堿物質(zhì)的測(cè)定

采用碘化鉍鉀（dragendorff）反應(yīng)測(cè)定發(fā)酵液中的生物堿物質(zhì)[14]。ε-聚賴氨酸是由單一L-賴氨酸的α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接而成的聚氨基酸，是一種生物堿物質(zhì)。生物堿物質(zhì)分別與兩種Dragendorff試劑（即改良的碘化鉍鉀試劑和碘化鉀碘試劑）發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，如果出現(xiàn)桔紅色沉淀和棕褐色沉淀，可以證明該菌株發(fā)酵后可以產(chǎn)生生物堿物質(zhì)。

發(fā)酵液經(jīng)6 000r/min離心15 min，取2 mL上清液分別與2 mL改良的碘化鉍鉀試劑和碘化鉀碘試劑反應(yīng)，然后觀察現(xiàn)象[10]。

1.3.6 ε-聚賴氨酸含量的測(cè)定

采用甲基橙比色法測(cè)定發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的含量[20]。

ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取ε-聚賴氨酸0.05g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g，采用pH 6.9、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解并定容至1 L。取等量不同質(zhì)量濃度的ε-聚賴氨酸溶液與等量1 mmol/L的甲基橙溶液混合均勻，于30℃、200r/min條件下反應(yīng)30min，6 000r/min離心15min，上清液經(jīng)pH 6.9、0.1 mol/L的PBS適當(dāng)稀釋后，以PBS為基準(zhǔn)，于波長(zhǎng)465 nm條件下測(cè)定吸光度值，以ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量的測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)6000r/min離心15 min，上清液取代ε-聚賴氨酸溶液后，按照ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定OD465nm值，根據(jù)ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響

出發(fā)菌株BNCC186223的孢子懸液經(jīng)20μL/mL硫酸二乙酯分別誘變處理20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min，誘變時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 誘變時(shí)間對(duì)菌株BNCC 186223致死率的影響Fig.1 Effect of mutagenesis time on the lethality of strain BNCC 186223

由圖1可知，采用20 μL/mL的硫酸二乙酯對(duì)白色鏈霉菌孢子懸液誘變處理45 min時(shí)，菌株的致死率為78.06%。根據(jù)遺傳育種的經(jīng)驗(yàn)，誘變菌株的致死率在70%～80%范圍內(nèi)最佳[16]。因此，確定硫酸二乙酯最佳誘變處理時(shí)間為45 min。

2.2 硫酸二乙酯含量對(duì)菌株致死率的影響

圖2 硫酸二乙酯含量對(duì)菌株BNCC 186223致死率的影響Fig.2 Effect of diethyl sulfate concentration on the lethality of strain BNCC 186223

出發(fā)菌株BNCC 186223的孢子懸液分別經(jīng)5 μL/mL、10μL/mL、15μL/mL、20μL/mL、25μL/mL硫酸二乙酯誘變處理45 min，硫酸二乙酯含量對(duì)菌株致死率的影響見圖2。

由圖2可見，采用10 μL/mL硫酸二乙酯對(duì)白色鏈霉菌孢子懸液誘變處理45 min時(shí)，菌株的致死率為74.81%，在70%～80%范圍內(nèi)。因此，確定硫酸二乙酯最佳誘變含量為10 μL/mL。

2.3 高產(chǎn)ε-聚賴氨酸誘變菌株的初篩

通過(guò)初篩共獲得48株產(chǎn)ε-聚賴氨酸的突變菌株，編號(hào)為DES-1～DES-48，其中5株突變菌株的H/C值比出發(fā)菌株BNCC 186223大，具體結(jié)果見表1。

表1 5株突變菌株的H/C值Table1 H/C value of 5 mutant strains

由表1可知，出發(fā)菌株BNCC186223的H/C值為1.43±0.03，5株突變菌株中，突變菌株DES-27的H/C值最大，為2.25±0.02，突變菌株DES-3的H/C值（2.16±0.03）次之，突變菌株DES-7的H/C值（1.67±0.01）最小。因此，挑選突變菌株DES-27進(jìn)行碘化鉍鉀（Dragendorff）反應(yīng)，驗(yàn)證菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物為生物堿性物質(zhì)。

2.4 高產(chǎn)ε-聚賴氨酸誘變菌株的復(fù)篩

2.4.1 生物堿物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

出發(fā)菌株BNCC 186223、突變菌株DES-27的發(fā)酵液上清液與碘化鉍鉀試劑和碘化鉀碘試劑均出現(xiàn)了明顯的絮狀沉淀，為碘化鉍鉀（Dragendorff）陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該白色鏈霉菌誘變前后均具有ε-聚賴氨酸生產(chǎn)能力。

2.4.2 ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 ε-聚賴氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of ε-polylysine

ε-聚賴氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。由圖3可知，ε-聚賴氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-1.452x+0.498，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5，線性關(guān)系良好，可用于發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量的測(cè)定。

2.4.3 發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量

出發(fā)菌株BNCC 186223和突變菌株DES-27發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 白色鏈霉菌BNCC 186223誘變前后發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的含量Table2 Content of ε-polylysine in fermentation broth byStreptomyces albusBNCC 186223 before and after mutagenesis

由表2可知，白色鏈霉菌BNCC 186223經(jīng)10 μL/mL硫酸二乙酯誘變45 min后，發(fā)酵液中的ε-聚賴氨酸含量為2.90 g/L，較誘變前（2.10 g/L）提高38.10%。

3 結(jié)論

產(chǎn)ε-聚賴氨酸白色鏈霉菌BNCC 186223經(jīng)10 μL/mL硫酸二乙酯誘變45 min，菌株致死率為74.81%；在此誘變條件獲得一株高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的突變菌株，編號(hào)為DES-27；其ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量為2.90 g/L，較誘變前（2.10 g/L）提高38.10%。結(jié)果表明，采用硫酸二乙酯對(duì)產(chǎn)ε-聚賴氨酸的白色鏈霉菌進(jìn)行化學(xué)誘變，可以提高產(chǎn)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量。