茶樹油提取物粉對小鼠免疫功能的影響

龐艷華，郝福星，韓玲玲，韋芊含，趙澤婷，陳昕,張雨梅,3*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，泰州 225300；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

茶樹為桃金娘科白千層屬植物，茶樹油是從其新鮮枝葉中提取的，經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的天然芳香精油[1-2]。茶樹油主要由單萜組成，具有抗細菌[3]，抗真菌[4]，抗病毒[5]和消炎等作用。在澳大利亞，茶樹油作為民間藥物常用來治療感染、炎癥、腹瀉和外傷[6]。在二戰(zhàn)期間，茶樹油也發(fā)揮了巨大作用，在治療傷員的皮膚損傷上效果顯著[7]。目前茶樹油是已發(fā)現(xiàn)的天然物質(zhì)中抗菌作用最強的，也是極具價值和發(fā)展?jié)摿Φ募兲烊恢参锞椭籟8-9]。

目前，我國對茶樹油無論是提取還是深加工都得到了很好的成果，，茶樹油及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用具有良好的前景。本研究擬通過灌胃給予小鼠茶樹油，首先進行急性毒性試驗，確定LD50值，然后通過小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性試驗、脾淋巴細胞增殖能力試驗、免疫器官指數(shù)試驗、測定血清溶血素水平及外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群水平，考察茶樹油提取物粉對小鼠免疫功能的影響，為探索茶樹油及其主要成分的作用，獲得可靠數(shù)據(jù)，以研制出新的茶樹油深加工產(chǎn)品，為茶樹油產(chǎn)品在日化、食品、香料、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)[10-11]。

1 材 料

1.1 實驗動物 ICR小鼠(清潔級)，體重18～22 g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2017-0004，使用許可證號為SYXK(蘇)2017-0044。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，環(huán)境溫度為(24±2)℃，濕度為(60±20)%，飲水為符合城市飲用水標準的自來水。試驗開始前于實驗環(huán)境中適應(yīng)3 d，灌胃前禁食12 h，不限制其飲水。

1.2 試驗藥品 茶樹油提取物粉(澳葉寶)，由20%澳洲茶樹油提取物與微晶纖維素制成的白色粉末，由江蘇無錫晨芳生物科技有限公司提供，批號為20160320。

表1 茶樹油提取物主要成分Tab 1 The main composition of the tea tree oil extract powder/%

1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國HyClone公司；100×青霉素鏈霉素溶液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT、小鼠淋巴細胞分離液、臺盼藍均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，MTT用pH7.2～7.4 PBS配成5 mg/mL的溶液，微孔濾器過濾除菌，4℃避光保存，不能超過1個月，現(xiàn)配現(xiàn)用；刀豆蛋白A Ⅳ(ConA，Ⅳ)，購自美國Sigma公司，20 μg/mL ConA 用RPMI1640完全培養(yǎng)液稀釋，微孔濾器過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用；DMSO，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方 法

2.1 急性毒性試驗 根據(jù)預試驗結(jié)果，茶樹油提取物粉劑量達5000 mg/kg b.w.時，小鼠未出現(xiàn)死亡。因茶樹油提取物粉的毒性較小，無法測出LD50數(shù)值，根據(jù)急性毒性試驗技術(shù)規(guī)范，對茶樹油提取物粉進行最大給藥量試驗。

取ICR小鼠20只，雌、雄各半，以0.2 mL/10g b.w.給藥容積灌胃，劑量為5000 mg/kg b.w.。連續(xù)觀察2周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

2.2 對小鼠免疫功能的影響

2.2.1 試驗分組 將ICR小鼠隨機分成4組，每組10只，雌雄各半。茶樹油提取物粉以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，灌胃給予。茶樹油提取物粉試驗組分為高劑量(1250 mg/kg b.w.)、中劑量(250 mg/kg b.w.)、低劑量組(50 mg/kg b.w.)以及1%羧甲基纖維素鈉對照組。以0.2 mL/10g b.w給藥容積灌胃，每天給藥一次，連續(xù)灌胃10 d后，分別進行以下試驗。

2.2.2 免疫器官指數(shù)試驗 ICR小鼠分組及處理同2.2.1。小鼠連續(xù)灌胃10天后，于第11天，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重及肝臟、脾臟、胸腺的重量，并按以下公式計算免疫器官指數(shù)(肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù))[12]。

免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重(g)/體重(g)×100%

2.2.3 腹腔巨噬細胞吞噬活性試驗 小鼠灌胃10 d后，于第11天，按照文獻[13]的方法，測定腹腔巨噬細胞吞噬活性。

2.2.4 脾淋巴細胞增殖試驗 小鼠灌胃10 d后，于第11天，無菌取脾、研磨后過200目不銹鋼網(wǎng)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液制成單細胞懸液。根據(jù)文獻[14]的方法，測定脾淋巴細胞增殖能力。

2.2.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群水平測定試驗 小鼠連續(xù)灌胃10 d，于末次灌胃12 h后，摘眼球采血0.5 mL，以4% EDTA-Na2抗凝。根據(jù)文獻[15]的方法，測定小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞水平。

2.2.6 血清溶血素水平測定試驗 小鼠分組及處理同2.2.1。于灌胃第3天 ，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的5%雞紅細胞進行免疫，小鼠免疫后再連續(xù)灌胃7 d，摘眼球取血，根據(jù)文獻[16]的試驗方法，測定血清溶血素。

2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS17.0軟件，以平均數(shù)±標準差表示。采用單因素分析Duncan's法進行顯著性分析，以P<0.05作為差異顯著性水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶樹油提取物粉的小鼠急性毒性試驗 茶樹油提取物粉按5000 mg/kg b.w.劑量灌胃給予小鼠后，二周內(nèi)未見明顯的眼觀異常。

茶樹油提取物粉對小鼠經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根據(jù)WHO對化學物急性毒性分級標準，茶樹油提取物粉屬于實際無毒級別。

3.2 茶樹油提取物粉對小鼠免疫器官的影響 不同劑量茶樹油提取物粉對小鼠免疫器官指數(shù)的影響見表3-1。與對照組相比，茶樹油高、中、低劑量組均能極顯著增加小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)； 250 mg/kg b.w.劑量組能顯著提高小鼠肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05)；50、1250 mg/kg b.w.劑量組的肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的差異不顯著(P>0.05)。

表3-1 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Tab 3-1 Effect on immune organ index in mice/%

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group, *P<0.05, **P<0.01

3.3 腹腔巨噬細胞吞噬活性試驗 不同劑量的茶樹油提取物粉對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響見表3-2。由表3-2可以看出，與對照組相比，茶樹油提取物粉三個試驗劑量，都可增加小鼠巨噬細胞的吞噬活性，但50 mg/kg b.w.劑量差異不顯著(P>0.05)；250 mg/kg b.w.劑量組差異極顯著(P<0.01)；1250 mg/kg b.w. 劑量組差異顯著(P<0.05)。

表3-2 對小鼠巨噬細胞吞噬活性、血清溶血素及脾淋巴細胞增殖的影響Tab 3-2 Effects of phagocytic activity, serum hemolysin and spleen lymphocyte proliferation in mouse macrophages

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.4 茶樹油提取物粉對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

不同劑量組茶樹油提取物粉對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響結(jié)果見表3-2。由表可以看出，與對照組相比，茶樹油提取物粉三個試驗劑量處理后，小鼠脾淋巴細胞刺激指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。50 mg/kg b.w.劑量組刺激指數(shù)顯著提高；250 mg/kg b.w.劑量組和1250 mg/kg b.w.劑量組刺激指數(shù)極顯著的升高，極顯著的增強了小鼠脾淋巴細胞增殖能力。

3.5 茶樹油提取物粉對外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群水平的影響 茶樹油提取物粉對小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群水平的影響結(jié)果見表3-3。與對照組相比，50 mg/kg b.w.劑量組CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；250 mg/kg b.w.劑量組CD4+/CD8+比值顯著增加(P<0.05)；高、中低劑量茶樹油提取物對小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD8+指標無顯著影響(P>0.05)。

表3-3 對小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴細胞亞群的影響Tab 3-3 Effects of CD3+, CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets in peripheral blood of mice

與正常對照組比較，*P<0.05

Compared with the normal control group,*P<0.05

3.6 茶樹油提取物粉對小鼠血清溶血素水平的影響

茶樹油提取物粉對小鼠血清溶血素的影響結(jié)果見表3-2。由表可以看出，與對照組相比，250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w. 劑量組中小鼠血清溶血素水平均顯著性增加(P<0.05)。但50 mg/kg b.w.劑量組中小鼠血清溶血素水平增加不顯著(P>0.05)。

4 討論與結(jié)論

4.1 小鼠急性毒性實驗 急性毒性實驗一般采用嚙齒類或非嚙齒類兩種動物。通常為小鼠或大鼠采用經(jīng)口、吸入或經(jīng)皮感染途徑。對小鼠進行一次或24 h內(nèi)多次接觸外源化學物后，觀察動物急性中毒表現(xiàn)，來了解新藥急性毒性的強弱，為長期毒性試驗和特殊毒性試驗劑量設(shè)置提供依據(jù)，同時為新藥藥學研究提供參考[17]。本試驗中茶樹油提取物粉經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，屬于實際無毒級別。

4.2 小鼠免疫器官與免疫功能 免疫器官是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，胸腺是T淋巴細胞分化成熟的部位，脾臟是機體內(nèi)最大的外周免疫器官，介導著全身的體液免疫和細胞免疫[18]。而肝臟又是體內(nèi)最大的解毒器官，機體主要靠肝臟來代謝，承擔著維持生命的重要功能。免疫器官指數(shù)是衡量機體免疫器官發(fā)育情況的經(jīng)典指標。本次試驗中，不同劑量的茶樹油提取物粉能顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)，對小鼠的脾臟發(fā)育有著極明顯的促進作用，而250 mg/kg b.w.劑量組的肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有顯著提高，效果最好。這說明茶樹油提取物粉能促進脾臟、肝臟和胸腺等免疫器官的增重，增強了機體的免疫功能。

4.3 腹腔巨噬細胞是評價免疫功能的重要指標 巨噬細胞廣泛分布于機體內(nèi)，在免疫反應(yīng)中具有重要作用，它不僅參與非特異性吞噬功能，還是特異性免疫中一類關(guān)鍵的細胞[19-20]。巨噬細胞能參與攝取、加工、處理、提呈抗原并激發(fā)免疫反應(yīng)。本次實驗中，通過對小鼠腹腔巨噬細胞的收集、分離和培養(yǎng)，探討茶樹油提取物粉對小鼠免疫功能的影響。實驗結(jié)果表明，茶樹油提取物粉三個試驗劑量，都可增加小鼠巨噬細胞的吞噬活性，這說明茶樹油提取物粉能提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性，促進小鼠巨噬細胞的吞噬作用。

4.4 小鼠脾淋巴細胞增殖是評價免疫功能的重要指標 小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)化功能可以作為特異性細胞免疫功能的指標，是評價機體免疫功能的重要指標之一，淋巴細胞的增殖狀況反映了機體細胞免疫的狀況。脾細胞的增殖能力可以通過研究脾臟T淋巴細胞在促分裂劑ConA作用下的增殖能力來反應(yīng)細胞免疫功能[24]。刺激指數(shù)SI值與活脾臟淋巴細胞數(shù)呈正相關(guān)。SI值越大，淋巴細胞增殖能力越強。試驗不同劑量組茶樹油提取物粉對小鼠脾淋巴細胞的增殖轉(zhuǎn)化影響。試驗結(jié)果表明，茶樹油提取物粉三個劑量組的SI值顯著高于正常對照組，這說明不同劑量組的茶樹油提取物粉能促進淋巴細胞的增殖轉(zhuǎn)化，且250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w.劑量組效果顯著。證實茶樹油提取物粉在一定劑量下能提高特異性細胞免疫功能，增強細胞免疫。

4.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群是評價免疫功能的重要指標 淋巴細胞亞群主管細胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用[25]，細胞功能取決于T淋巴細胞總值(CD3+)及其亞群(CD4+、CD8+)的相對組成。流式細胞分析儀FCM根據(jù)淋巴細胞表面標志的不同來檢測各淋巴細胞亞群。用CD4+/CD8+比值來判斷機體內(nèi)部是否紊亂，CD4+/CD8+比值上升，則表明細胞免疫功能活躍，反之則細胞免疫功能處于遲滯狀態(tài)[26]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹油提取物粉250 mg/kg b.w.劑量組CD4+/CD8+比值顯著增加(P<0.05)，表明細胞免疫功能處于活躍狀態(tài)，其他劑量組與對照組相比差異不顯著。這說明250mg/kg b.w.劑量的茶樹油提取物粉對細胞免疫功能有促進作用，能提高機體的免疫功能。

4.6 血清溶血素是評價免疫功能的重要指標 小鼠血清溶血素的水平是一項機體非特異性免疫功能的主要指標[20-21]，溶血值的測定反映了B細胞的增殖分化以及與補體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力，其介導的是體液免疫[22]。通過測定溶血素值，用以檢測藥物對機體防御能力的影響[23]。本實驗中，茶樹油提取物粉三個試驗劑量組中，小鼠血清溶血素水平都有所增加，這說明茶樹油提取物粉具有刺激B細胞分化增殖轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細胞的功能，促進小鼠溶血素抗體的生成，提高抗體水平，增強小鼠體液免疫功能。

4.7 結(jié)論 茶樹油提取物粉經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根據(jù)WHO對化學物急性毒性分級標準，茶樹油提取物粉屬于實際無毒級別。

不同劑量的茶樹油提取物粉對小鼠的脾臟指數(shù)都有著極明顯的促進作用，對肝指數(shù)和胸腺指數(shù)也有一定的促進作用。

茶樹油提取物粉通過促進小鼠巨噬細胞的吞噬活性、淋巴細胞的增殖、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶樹油提取物粉對小鼠免疫功能具有促進作用。

茶樹油提取物粉通過增加免疫器官指數(shù)、增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性、脾淋巴細胞的增殖能力、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶樹油提取物粉對小鼠免疫功能具有一定的促進作用。