2017年我國(guó)豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

胡星星，郭龍，宋文博，賈雙，袁意，喻紅艷，湯細(xì)彪

(武漢科前生物股份有限公司，武漢430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida, Pm)是一種革蘭陰性兼性厭氧球桿菌，正常定植于多種健康動(dòng)物的口腔、鼻咽和上呼吸道[1]。當(dāng)Pm大量繁殖導(dǎo)致內(nèi)源性感染時(shí)可引起豬、禽、牛、羊、兔等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病、局灶性感染及出血性敗血癥[2-3]。此外，Pm還可通過(guò)貓狗咬傷、抓傷或舔舐感染人，威脅人類健康[1,4]。根據(jù)莢膜抗原的不同，Pm可分為A、B、D、E和F五個(gè)血清型。不同血清型可引起不同的疾病癥狀[5-8]，其中A型和D型產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌可以引起豬萎縮性鼻炎，造成世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失[7]。某些區(qū)域流行的血清型可隨時(shí)間變化，如1990年之前我國(guó)最流行A型和B型，其次為D型[9]。30年之后，A型和D型成為我國(guó)主要流行血清型，然后是B型[10]。目前豬巴氏桿菌病的控制主要依賴抗生素，然而，Pm易與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染的特點(diǎn)[4]和臨床上濫用抗菌藥導(dǎo)致多重耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重的問(wèn)題致使該病的防控極具挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2017年我國(guó)Pm的流行情況及其耐藥情況進(jìn)行研究，以期為該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DL2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。胰蛋白大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自美國(guó)BD公司；輔酶I (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司，20種藥敏試紙均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.2 樣品來(lái)源 樣品來(lái)自于全國(guó)24個(gè)省市的規(guī)模化豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶送檢的有呼吸系統(tǒng)疾病癥狀病死豬的肺臟組織以及少量氣管、腦、肝臟、脾臟等其他組織樣品，共6288份。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌剪取肺臟等病變組織，劃線接種于含10 mg/L NAD和5%(V/V)新生牛血清的TSA平板上。將TSA平板置于37 ℃、50 mL/L CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)并挑取優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌的PCR鑒定 根據(jù)Townsend等[11]建立的PCR方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行種屬鑒定和莢膜血清學(xué)分型。本實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)Pm及其莢膜血清型的引物(表1)均由北京擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

Pm的PCR鑒定/血清型分型的反應(yīng)體系如下(20 μL/25 μL)：2×Easy Taq PCR SuperMix(+ dye)10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板1 μL，無(wú)核酸水補(bǔ)至20 μL/ 25 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行7.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Tab 1 PCR primers used in this experiment

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 對(duì)經(jīng)PCR鑒定并分型的Pm分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取培養(yǎng)好的菌液用無(wú)菌棉簽均勻涂布在TSA培養(yǎng)基上，用鑷子夾取藥敏紙片放置在平板上，每個(gè)平板上不超過(guò)6張藥敏紙片。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)24～36 h后測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pm的分離鑒定及血清型分型 從6288份病死豬肺臟和其他病料組織中共分離出236株P(guān)m，總分離率為3.75%。從236株P(guān)m中隨機(jī)挑出55株進(jìn)行PCR鑒定及血清型分型，其中A型菌株25株，D株菌株27株，F(xiàn)型菌株1株，未定型菌株2株，部分菌株的PCR鑒定如圖1所示。

2.2 Pm的地區(qū)流行情況 對(duì)各省市的地區(qū)分離率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示，廣東省的地區(qū)分離率最高(4.97%，54/1087)，其次為湖南省(4.64%，15/323)，然后是河南省(3.69%，38/1030)、四川省(3.61%，9/249)、山東省(3.50%，9/257)和湖北省(3.25%，69/2125)，最后是福建省(1.87%，4/214)。其余各省份地區(qū)樣品數(shù)目少，且分離率較低，合計(jì)后其總分離率為3.79%(38/1003)。

M.DL2000 DNA marker；1.Pm的鑒定產(chǎn)物；2.A型菌株P(guān)CR產(chǎn)物；3.D型菌株P(guān)CR產(chǎn)物；4.F型菌株P(guān)CR產(chǎn)物；5.陰性對(duì)照M: DL2000 DNA marker; 1. PCR product of Pm for identifying; 2. PCR product for capsular type A; 3. PCR product for capsular type D; 4. PCR product for capsular type F; 5. Negtive control圖1 多殺性巴氏桿菌的PCR鑒定及莢膜分型Fig 1 Identification and capsular typing of Pm by PCR

圖2 2017年我國(guó)豬源多殺性巴氏桿菌地區(qū)分布圖Fig 2 Map of the regional distribution of Pasteurella multocida in 2017 in China

2.3 Pm的單純感染和混合感染情況 在分離出Pm的236份病料中，僅分離出Pm的病料有101份，所占比例為42.80%，其余135份病料能同時(shí)分離出Pm和其他各種不同的共感染菌，占比57.2%。如圖3所示，兩種菌混合感染時(shí)最常見(jiàn)的共感染菌為鏈球菌(28.81%，68/236)，其次是副豬嗜血桿菌(12.29%，29/236)，然后是大腸桿菌(2.12%，5/236)、葡萄球菌(1.69%，4/236)和支氣管敗血波氏桿菌(1.27%，3/236)，豬丹毒絲菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌也偶爾共感染。三種菌混合感染時(shí)最常見(jiàn)的共感染菌為鏈球菌和葡萄球菌(4.24%，10/236)，其次是鏈球菌和副豬嗜血桿菌(3.81%，9/236)，最后是鏈球菌和大腸桿菌(1.69%，4/236)。

Pm.多殺性巴氏桿菌；SS.豬鏈球菌；HPS.副豬嗜血桿菌；E.coli.大腸桿菌；Bb.支氣管敗血波氏桿菌；S.hyicus.葡萄球菌；APP.傳染性胸膜放線桿菌；SE.豬丹毒桿菌Pm. Pasteurella multocida; SS. Streptococcus suis; HPS. Haemophilus parasuis; E.coli. Escherichia coli; Bb. Bordetella bronchiseptica; S.hyicus. Staphylococcus; APP. Actinobacillus pleuropneumoniae; SE. Swine erysipelas圖3 2017年我國(guó)豬源多殺性巴氏桿菌感染情況Fig 3 Infection of Pasteurella multocida in 2017 in China

2.4 Pm的耐藥情況 經(jīng)鑒定并分型的55株P(guān)m對(duì)20種臨床常用抗菌藥物的敏感性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，由表可知Pm對(duì)強(qiáng)力霉素的耐藥率最高(83.64%)，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和阿米卡星等氨基糖苷類藥物的耐藥率次之(43.64%～52.73%)，對(duì)氨芐青霉素、壯觀霉素、甲氧胺嘧啶和環(huán)丙沙星也有較高的耐藥率(21.82%～29.09%)。Pm對(duì)氧氟沙星和多粘菌素B的耐藥率最低(均為1.82%)，另外Pm對(duì)頭孢類抗生素、阿莫西林、阿奇霉素等耐藥性也較低。

表2 55株豬源多殺性巴氏桿菌分離株對(duì)20種藥物的敏感性Tab 2 The sensitivities of 55 strains of porcine Pasteurella multocida isolates to 20 drugs

3 討論與結(jié)論

Pm是豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)的重要致病原之一。Tang X等從2003-2007年采集的2912份呼吸道疾病病料中分離出233株P(guān)m，總分離率為8.0%[10]；LIU H等報(bào)道2011至2015年我國(guó)12個(gè)省病料中Pm的分離率為9.2%(295/3212)[12]；本文的研究結(jié)果顯示2017年來(lái)自我國(guó)24個(gè)省市的6288份病料中Pm的總分離率為3.7%，相比其他學(xué)者的報(bào)道總分離率明顯下降，一方面可能是由于樣品來(lái)源地區(qū)和病料份數(shù)增多，另一方面也說(shuō)明隨著我國(guó)養(yǎng)殖水平的提高，大部分豬場(chǎng)對(duì)豬巴氏桿菌病等細(xì)菌病的防控更加規(guī)范、有效。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選的55株P(guān)m中A型和D型菌株的占比分別為45.5%(25/55)和49.1%(27/55)，相較于2003年至2007年的占比(39.5%和54.9%)[10]和2011年至2015年的占比(49.3%和47.6%)[12]有所變化，可能與樣品來(lái)源地區(qū)增加和不同地區(qū)流行的主要血清型不同有關(guān)。例如湖南省主要流行A型菌株(64.5%)，其占比明顯高于D型菌株(30.6%)[13]；而河南省A型菌株和D型菌株占比分別為43.86%和56.14%[14]。

Pm屬于條件致病菌，在豬抵抗力低下時(shí)可侵入機(jī)體而發(fā)生內(nèi)源性感染。Gao等認(rèn)為炎熱和潮濕的氣候會(huì)增加豬巴氏桿菌病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15]，這可能是廣東省的Pm地區(qū)分離率(4.97%)明顯高于總分離率(3.75%)的原因之一。河南省和湖北省的地區(qū)分離率(分別為3.69%和3.25%)接近總分離率，且Pm分離株占比較大(分別為16.10%和29.24%)。盡管湖南省和山東省的Pm地區(qū)分離率分別高達(dá)4.64%和3.50%，但是其Pm分離株所占比例均較少(6.36%和3.81%)，且檢測(cè)病料份數(shù)相對(duì)較少(323份和257份)。

Pm常與多種病原發(fā)生混合感染，從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和死亡率，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。本研究?jī)H分離出Pm株數(shù)所占比例(42.80%)不到總Pm分離株的一半，表明Pm與其他細(xì)菌發(fā)生混合感染的情況非常普遍，其中與鏈球菌和副豬嗜血桿菌最為多見(jiàn)，Tang X和Zhao Z等也曾報(bào)道過(guò)相似的結(jié)果[10,16]。因此，在治療豬巴氏桿菌病時(shí)需多管齊下，針對(duì)這些共感染菌的多價(jià)疫苗而非針對(duì)Pm的單價(jià)疫苗的研制是控制該病的方向之一[12]。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果顯示，Pm對(duì)氧氟沙星、多粘菌素B、頭孢類和阿莫西林的耐藥率均較低，臨床上常用頭孢類抗生素和阿莫西林來(lái)控制Pm。Pm對(duì)強(qiáng)力霉素的耐藥率高達(dá)83.64%，這與臨床上該類藥物的廣泛使用和本身特點(diǎn)有關(guān)，混合感染的細(xì)菌間交換四環(huán)素耐藥基因會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的選擇壓力[17]。Pm對(duì)青霉素類、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對(duì)較高，與2016年上海市分離的20株P(guān)m的耐藥性相似[18]。定期監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性可有效避免藥物濫用，并指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥。