UPLC-PDA法測定蒲公英提取物中咖啡酸的含量

魏秀麗，徐恩民，劉霄飛，李有志*，張秀英，王海軍

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；4.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102206；5.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand-Mazz、堿地蒲公英TaraxacumborealisineseKitam或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，無毒，用于疔瘡腫毒、乳癰、咽痛、濕熱黃疸、熱淋澀痛。蒲公英同時(shí)含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，是藥食兼用的食物。藥材及相關(guān)制劑被收錄于中華人民共和國藥典和獸藥典[1-2]。由于其良好的治療效果和親民的價(jià)格，蒲公英提取物在獸藥中的研究也成為熱點(diǎn)，對其有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制成為必然。蒲公英主要含有黃酮類、酚酸類、糖類、倍半萜內(nèi)酯類等成分，其中以咖啡酸為代表成分。

有文獻(xiàn)報(bào)道采用薄層色譜法(TLC)為蒲公英提取物制定定性鑒別方法；采用高效液相色譜(HPLC)法測定其咖啡酸含量[1-8]。前者耗時(shí)較長，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了改進(jìn)。本文對經(jīng)水提醇沉的蒲公英提取物，采用超高效液相色譜法對其有效成分咖啡酸進(jìn)行定性和定量檢測，方法經(jīng)濟(jì)快速，滿足日常檢測需求，為下一步蒲公英提取物的工藝調(diào)整和優(yōu)化方案的篩選提供最快速的檢測方法，為制定檢測標(biāo)準(zhǔn)提供方法借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.00001g；儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀。

1.2 藥品及試劑 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，批號110885-201703，含量99.7%，中國食品藥品檢定研究院。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。蒲公英提取物為水提醇沉，北京生泰爾科技股份有限公司小試生產(chǎn)的產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：水溶液(0.4%磷酸)，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為323 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

2.2 樣品制備

2.2.1 樣品 蒲公英提取物

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取咖啡酸對照品9.36 mg，加甲醇至100 mL，制成100 μg/mL的溶液，作為咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始比例流動相稀釋，制備成系列濃度為： 1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 蒲公英提取物樣品的制備 精密稱取蒲公英提取物樣品約0.5、0.2、0.1、0.05 g，置15 mL離心管中，加5%甲酸甲醇溶液溶解并定容至10 mL，超聲30 min，5000 rpm.離心10 min，過濾至15 mL離心管中，作為樣品初始液；分別精密量取相應(yīng)濃度的樣品初始液適量，用初始比例流動相稀釋5倍，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，上機(jī)測試。

2.3 方法線性考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 咖啡酸對照品和蒲公英提取物樣品待測液，在2.1項(xiàng)條件下，色譜保留時(shí)間為3.45 min左右見圖1-圖2。光譜圖見圖3-圖4。

圖1 10ug/mL咖啡酸對照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of 10ug/mL caffeic acid reference substance

圖2 蒲公英提取物樣品中咖啡酸色譜圖Fig 2 Caffeic acid chromatogram of dandelion extract sample

圖3 10ug/mL咖啡酸對照品光譜圖Fig 3 Spectra of 10ug/mL caffeic acid reference substance

圖4 蒲公英提取物樣品中咖啡酸光譜圖Fig 4 caffeic acid spectrum of dandelion extract sample

由光譜圖可以看出對照品和樣品中咖啡酸的紫外最大吸收波長分別為324.4、323.2 nm。測試比較323與324 nm波長的峰面積，323 nm處咖啡酸峰面積更大些，見表2。定量檢測時(shí)選擇323 nm波長。

表2 不同波長的峰面積比較Tab 2 Comparison of pesk area of different wavelengths

2.3.2 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各雜質(zhì)峰，在1～100 μg/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=70200x+38300，Y為咖啡酸峰面積，X為咖啡酸的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，線性良好。見圖5。

圖5 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 5 Standard curve of caffeic acid

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 配制10 μg/mL咖啡酸對照品溶液，重復(fù)6份，進(jìn)樣，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.82%。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取10 μg/mL咖啡酸對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.51%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下10 μg/mL咖啡酸對照品溶液，在室溫放置3、6、12、24 h;在4 ℃放置3、6、12、24 h后，各進(jìn)樣5 μL，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.73%。

2.3.6 檢測限和定量限 0.25 μg/mL咖啡酸對照品溶液信噪比>3為檢出限，1 μg/mL 咖啡酸對照品溶液信噪比>10為定量限。

2.3.7 取樣量及校正方法的選擇 稱取蒲公英提取物樣品約0.5、0.2、0.1、0.05 g，各2個(gè)平行，處理后，約為0.5 g稱樣量的上機(jī)溶液的峰面積與10 μg/mL的對照品溶液的峰面積較為接近，其他的峰面積按比例減小，最終選取5 μg/mL的對照品溶液對約0.2 g稱樣量的上機(jī)溶液進(jìn)行定量計(jì)算，平均值為0.77 mg/g，與按標(biāo)準(zhǔn)曲線含量計(jì)算結(jié)果0.785 mg/g相差0.015 mg/g，隨著取樣量的減少，兩者計(jì)算的偏差越來越大，見表3，最終選擇稱取0.2 g樣品進(jìn)行處理，并按照相近峰面積濃度的單點(diǎn)計(jì)算含量。

表3 不同校正方法的含量結(jié)果比較Tab 3 comparison of content results of different correction methods

2.3.8 添加回收試驗(yàn) 精密稱取蒲公英提取物樣品約0.1 g，置15 mL離心管中，加8 mL咖啡酸對照品儲備液，加5%甲酸甲醇溶液2 mL，同供試品同樣處理上機(jī)測試?；厥章试?4%～101%的范圍內(nèi)，滿足準(zhǔn)確度的要求。

表4 咖啡酸添加回收率結(jié)果Tab 4 Results of recovery for caffeic acid

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選擇了超高效液相色譜法對蒲公英提取物中的咖啡酸進(jìn)行定性和定量測定。與2015版中國獸藥典[1]、中國藥典[2]中蒲公英的檢測方法和文獻(xiàn)報(bào)道方法相比[3-8]，一是鑒別采用了光譜法，省卻了薄層色譜法鑒別[1-2]繁瑣的操作，節(jié)省了多種如乙酸乙酯、乙酸丁酯等有機(jī)溶劑的使用，保護(hù)了環(huán)境；二是采用了UPLC，定量的色譜圖出峰保留時(shí)間提前至3.5 min左右，運(yùn)行時(shí)間短12 min，流速0.35 mL/min，比文獻(xiàn)HPLC方法[1-8]節(jié)省了大量的流動相；三是摒棄了甲醇：磷酸鹽緩沖液等[1-8]作為流動相，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風(fēng)險(xiǎn)。

使用超高效液相色譜-PDA檢測器，對蒲公英提取物中的咖啡酸進(jìn)行定性和定量測定，方法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，經(jīng)濟(jì)可行，綠色環(huán)保，并為生產(chǎn)企業(yè)下一步調(diào)整優(yōu)化蒲公英提取物的生產(chǎn)工藝提供快速的檢測方法。