黃酮類化合物分離純化技術(shù)研究現(xiàn)狀

焦月華，樸成玉，嚴 妍，于 敏，賈博宇，周忠光

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040）

黃酮類化合物屬于植物的次級代謝產(chǎn)物，在植物內(nèi)部大部分與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在，多存在于高等植物及羊齒類植物中，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的8 000多種黃酮類化合物存在于5 000多種植物中[1]。根據(jù)苯環(huán)間連接位置、氧化程度以及是否成環(huán)等將黃酮類化合物分為黃酮和黃酮醇類、二氫黃酮和二氫黃酮醇類、異黃酮和二氫異黃酮類、查爾酮和二氫查爾酮類、橙酮類、花色素和黃烷醇類以及其他黃酮類[2]。

黃酮類化合物具有降低血管脆性及異常的通透性、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓形成、抗肝臟病毒、抗炎、抗菌、解栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗癌、防癌、降血糖、鎮(zhèn)痛和免疫等生理活性[3-6]。這些生理活性已被關(guān)注，對該類化合物的研究成為醫(yī)藥界的熱門課題。人體自身不能合成黃酮類化合物而只能從食物中攝取，因此多年來科學(xué)家都在積極研究探討從植物體中分離純度高、活性強的黃酮類化合物[7]。

1 黃酮類化合物的提取

黃酮類化合物在花、葉、果等組織中多以苷元的形式存在，而在根部堅硬組織中，則多以游離苷元形式存在。因此，不同來源、部位、種類黃酮提取所采取的方法不同[7]。分離黃酮類化合物的方法很多，根據(jù)黃酮類化合物與混入其他化合物的極性不同可采用溶劑萃取法，根據(jù)黃酮化合物在酸性水中難溶、堿性水中易溶的特點可采用堿提酸沉法，根據(jù)黃酮類化合物對不同物質(zhì)的解離性不同可采用離子交換法等。

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是目前黃酮類化合物提取最常用的方法之一。其優(yōu)點是操作過程相對簡單，去除雜質(zhì)效果較好，萃取后澄明度較高。溶劑萃取過程中不僅可以除去雜質(zhì)還可以起到分離苷和苷元或極性苷元與非極性苷元的效果。該方法的缺點是萃取過程中苷類物質(zhì)及其他有效成分會有部分損失，同時其他一些難溶于水的有效成分還可能在經(jīng)醇處理后沉淀，所以在處理前應(yīng)多次試驗所用溶劑的種類和濃度。常用的溶劑系統(tǒng)有水-醋酸乙酯、正丁醇-石油醚等。

1.2 微波提取法

微波提取法是將微波與萃取相結(jié)合的一種方法。其基本原理是當微波在傳輸過程中遇到不同的物質(zhì)，會根據(jù)該物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生反射、吸收和穿透現(xiàn)象，因此可以選擇性加熱待分離基體中欲提取組分所在的區(qū)域，從而將其從待分離基體或體系中分離提取，使之進入提取劑[4]。具有回收率高、選擇性強、加熱快、節(jié)約能源、無污染等優(yōu)點。

1.3 超聲波法

超聲波提取技術(shù)的原理是利用超聲的空化作用、熱效應(yīng)和機械作用加速被提取成分的浸出，此外超聲波的次級效應(yīng)（化學(xué)效應(yīng)、攪拌作用、乳化作用）破壞細胞使其加速被提取成分的釋放、擴散和溶解。與常規(guī)提取法相比，超聲波法的優(yōu)點比較突出，例如能獲得較高的產(chǎn)率且無需加熱、提取時間短等。

1.4 酶解法

當恰當?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧蠒r，會破壞細胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而減小有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴散時細胞壁與細胞間質(zhì)等屏障的傳質(zhì)阻力作用。雖然酶解法作用條件溫和，也有其局限性：酶有最適溫度和最適pH，所以酶解時實驗設(shè)備應(yīng)能夠較好的控制溫度和pH；酶解過程中可能會因為與某些成分發(fā)生反應(yīng)引起結(jié)構(gòu)變化而產(chǎn)生其他化學(xué)物質(zhì)，因此會影響產(chǎn)物的純度及收率[8]。

1.5 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取是一項萃取新技術(shù)，待分離的物質(zhì)在超臨界狀態(tài)下與超臨界流體接觸后，根據(jù)其極性、沸點和相對分子質(zhì)量的不同，而依次被萃取、分離出來。超臨界CO2萃取法萃取率高且能最大限度保持提取物的天然特征、避免高溫、沒有有機溶劑殘留、生產(chǎn)周期短等諸多優(yōu)點而越來越受到青睞[9]。但是超臨界CO2萃取的極性小，更適宜提取低分子、低極性、親脂性、低沸點的成分，而在提取相對分子質(zhì)量較大、極性集團多的成分時需要加入合適的夾帶劑來改變原有成分的溶解度。夾帶劑往往是具有很好溶解性能的溶劑，例如甲醇、丙酮等。

1.6 半仿生提取技術(shù)

半仿生提取法是整體藥物研究法與分子藥物研究法的整合，該方法模仿口服藥在胃腸道中的轉(zhuǎn)運過程，提取含待分離成分高的“活性混合物”，采用選定pH的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取，因此該方法可以提取和保留更多的有效成分，并能降低成本、縮短生產(chǎn)周期，更適用于一些經(jīng)消化道給藥的中草藥制劑。

1.7 超速離心法

超速離心法常作為膜分離法的前處理工藝。工作原理是通過離心機離心加速度在超過重力加速度時能夠加速藥液中雜質(zhì)的沉淀從而將其除去。超速離心法的優(yōu)點是提取后的溶液中有效成分含量高，基本能將藥液充分回收，且操作省時、省力、澄明度高等。但該方法僅適用于分離不易沉降的懸浮液卻無法除去糖類及其他不易沉降的雜質(zhì)。

2 黃酮類化合物的分離

經(jīng)提取的黃酮類化合物僅僅是粗提物，含有其他雜質(zhì)混合物，而且混合有多種成分的黃酮類化合物，還需進一步分離純化。常用分離方法有色譜法、硼酸絡(luò)合法、pH梯度萃取、分子烙印技術(shù)等。

2.1 色譜法

2.1.1 柱色譜

柱色譜分離黃酮類化合物常用的吸附劑或載體有硅膠、聚酰胺及纖維素粉等。硅膠柱色譜：色譜適用范圍廣，可用于多種類型的黃酮類化合物的分離；聚酰胺柱色譜：因聚酰胺富含酚羥基，可形成氫鍵締合產(chǎn)生吸附，適用于分離苷、苷元、查耳酮與二氫黃酮等各種類型的黃酮類化合物[10]。葡聚糖凝膠：用葡聚糖凝膠分離黃酮苷時，主要起分子篩的作用，在進行洗脫時，黃酮苷類流出柱體的順序與相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，基本上是按照相對分子質(zhì)量從大到小依次流出；環(huán)糊精鍵合凝膠柱：β環(huán)糊精是一種同時具有多羥基外周和疏水空腔的圓筒形分子，黃酮類化合物能夠與環(huán)糊精配基同時生成氫鍵并發(fā)生疏水作用，從而為色譜分離過程提供保留力，譚天偉等利用環(huán)糊精鍵合凝膠介質(zhì)分離純化葛根素、表沒食子兒茶素以及槲皮素、山奈酚和異鼠李素，效果良好[11]。大孔樹脂吸附性能是由于范德華力或生成氫鍵的結(jié)果，在確定分離條件時，首先要選擇樹脂的孔徑，孔徑的選擇要參考被分離化合物分子體積的大小，其次要選擇樹脂的型號和分離條件，這要考慮分子中是否含有羧基、酚羥基或堿性氮原子等官能團。大孔樹脂常用的洗脫劑有水、梯度乙醇、甲醇和丙酮等[12]。

2.1.2 加壓毛細管電色譜法

加壓毛細管電色譜是一種新型微分離分析技術(shù)，直流高壓電場加壓與填充有微細顆粒HPLC填料的毛細管電色譜柱兩端，大幅提高了樣品分離能力，該方法適用于復(fù)雜生物及化學(xué)體系的研究[13]。該方法中樣品在毛細管柱中的保留行為同時受到電滲流及其在流動相與固定相之間分配系數(shù)的雙重影響，使分辨能力得到極大提高。Wang等利用加壓毛細管電色譜法（pCEC）來測定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中黃酮類化合物的異同[14]。

2.1.3 薄層色譜

薄層色譜是一種快速、簡便、高效、經(jīng)濟、應(yīng)用廣泛的色譜分析方法。常規(guī)的薄層色譜法存在展開時間長、展開劑體積需求大和分離結(jié)果差等缺點[15]。離心薄層色譜則可以替代制備型薄層色譜，有時甚至能替代柱色譜，分離速度快、處理量大[16]。張超等利用離心薄層色譜成功的從地菍中分離出槲皮素、廣寄生苷和山柰酚[17]。

2.1.4 高效制備液相色譜

高效制備液相色譜（HPLC）正相系統(tǒng)的固定相有硅膠柱和氨基柱，反相系統(tǒng)的固定相有C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱及C2柱等[18]。流動相一般用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)，并加入少量的酸來改善分離效果，防止拖尾[19]。Biesaga等利用RP HPLCUV-MS監(jiān)測馬鈴薯成熟過程中某些黃酮類物質(zhì)含量的變化[20]。但因為其成本比經(jīng)典柱色譜要高，因此多用于定性與定量分析或者少量物質(zhì)的純化。

2.1.5 高速逆流色譜分離法

高速逆流色譜分離法（HSCCC）是一種新的分離技術(shù)。其線圈中固定相不需要載體，因而清除了氣液色譜中由于使用載體而帶來的吸附現(xiàn)象，用于制備性分離時，每次進樣體積較大，進樣量也較多[9]。Yuan等提取木蝴蝶葉子中黃酮類化合物，經(jīng)HSCCC分離純化的效果很好[21]。

2.2 pH梯度萃取

pH梯度萃取法是分離酸性、堿性、兩性成分常用的手段。黃酮類化合物由于酚羥基的取代而顯酸性，因羥基的數(shù)目和位置不同，酸性強弱也不同。pH梯度萃取的原理是由于溶劑系統(tǒng)pH變化改變了其存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變了其在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。分離酸性強弱不同的黃酮類化合物，可用pH由低至高的堿性緩沖溶液順次萃取，使酸性由強到弱的黃酮類化合物分別萃取出來。

2.3 分子烙印技術(shù)

分子烙印技術(shù)是對特定目標分子制備具有高選擇識別性能材料的技術(shù)[22-23]。分子烙印技術(shù)需要首先制作分子烙印聚合物介質(zhì)，這也是分子烙印技術(shù)的關(guān)鍵。通常制作聚合物介質(zhì)需要3個步驟，首先由聚合物單體溶液與將被分離的目標分子形成復(fù)合物，再加入交聯(lián)劑使復(fù)合物產(chǎn)生聚合反應(yīng)，最后除去包埋在聚合物中的目標分子，就得到分子烙印聚合物介質(zhì)。該介質(zhì)對目標分子的結(jié)構(gòu)具有記憶功能，當再次遇到目標分子時，聚合物便可進行選擇性識別。按照單體與模板分子間形成復(fù)合物的作用力不同，分子烙印技術(shù)可分為共價型、非共價型和半共價型[11,16]。

2.4 雙水相提取

雙水相提取技術(shù)優(yōu)點是兩相分相時間短，分相過程溫度低，操作簡單，提取率高。同時因為PEG及鹽類對人體和環(huán)境沒有毒害，所以雙水相提取被稱為黃酮化合物富集分離的有效方法之一。石慧等利用PEG400 25%和（NH4）2SO412%組成的雙水相體系萃取分離加楊葉中的總黃酮，經(jīng)過優(yōu)化，萃取率＞95%，為黃酮類化合物萃取分離的一種有效方法[24]。

2.5 膜分離法

膜分離法是以濾膜為分離介質(zhì)，以壓力為推動力，依靠膜的選擇性，將溶液中的混合物分成保留液與通過液兩部分，從而按相對分子質(zhì)量依次將各組分分離、純化、濃縮。根據(jù)孔徑不同分為微濾、超濾、納濾、反滲透等。膜分離是一種物理過程在常溫下操作，不需要發(fā)生相變化也不需要添加助劑，因而適于分離熱敏性、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的藥物[9]。超濾法（UF）介于微濾與納濾之間，通過控制超濾膜孔徑大小，能有效除去提取液中大分子物質(zhì)，但因目前膜材料的品種較少，膜孔徑分布范圍較寬而影響了分離性能。

3 結(jié)語

提取分離黃酮類化合物的方法很多，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出很多新方法和新設(shè)備，使提取分離效率不斷提高。目前在黃酮類化合物的提取方法中，一些傳統(tǒng)方法仍占主導(dǎo)地位，但也逐漸暴露出許多問題，如能量消耗大、提取分離周期長、溫度要求高、有效成分易被破壞、殘留的溶劑污染環(huán)境、浪費資源等。一些新興技術(shù)如超濾技術(shù)、微波技術(shù)等具有能耗小、周期短、產(chǎn)率高、純度高、有利于保護有效成分不被破壞等特點而日益受到人們關(guān)注。黃酮類化合物提取的發(fā)展方向應(yīng)在優(yōu)化現(xiàn)有傳統(tǒng)提取工藝的同時，開發(fā)、完善并普及新興技術(shù)。

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