基于網絡藥理學的補陽還五湯防治阿爾茨海默病的機制研究

汪白云 劉國良 樸成玉 陳巧云 陳景華 薛慧 劉斌

[摘要] 目的 預測發(fā)現補陽還五湯防治阿爾茨海默?。ˋD）的作用靶標，探討多成分-多靶點-多通路的協同作用機制。 方法 基于網絡藥理學方法針對補陽還五湯的方劑組成，采用多元網絡藥理學方法預測補陽還五湯的體內作用靶標，通過BATMAN-TCM等數據庫對比補陽還五湯抗AD藥物靶標，最終采用Cytoscape軟件構建補陽還五湯成分-靶點-通路的網絡。 結果 補陽還五湯中活性成分涉及多個與AD直接相關的體內靶標，如載脂蛋白E（APOE）等。同時涉及多個代謝通路，如甘油磷脂代謝、膽堿能突觸、膽固醇代謝、AD通路等。 結論 補陽還五湯主要通過多成分協同起效，如1-十六碳烯對載脂蛋白E調節(jié)間接起到調控疏水性淀粉樣β（Aβ）沉淀形成、藏花醛對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的抑制作用等，進而延緩AD的發(fā)生發(fā)展。

[關鍵詞] 網絡藥理學;補陽還五湯;阿爾茨海默病;靶點;載脂蛋白E

[中圖分類號] R749? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0012-04

[Abstract] Objective To predict and discover the target of Buyang Huanwu Decoction in the prevention and treatment of Alzheimer′s disease （AD） and explore the synergistic mechanism of multi-component， multi-target and multi-pathway. Methods According to the composition of Buyang Huanwu Decoction， the in vivo target of Buyang Huanwu Decoction was predicted by multiple network pharmacology methods. The target of anti-AD drug was selected by BATMAN-TCM and other databases. Finally， the components of Buyang Huanwu Decoction were constructed by Cycaptose software for target path network. Results The active components of Buyang Huanwu Decoction were involved in many targets directly related to Alzheimer′s disease， such as apolipoprotein E （APOE）. At the same time， it involves many metabolic pathways， such as glycerol phospholipid metabolism， cholinergic synapses， cholesterol metabolism， Alzheimer′s disease pathway and so on. Conclusion Buyang Huanwu Decoction mainly works through multi-component synergy， such as 1-hexadecence regulates apoliporotein E indirectly to regulate the formation of hydrophobic amyloid β （Aβ）， the inhibition of safranal on acetylcholinesterase and butyrocholinesterase， thus delaying the occurrence and development of AD.

[Key words] Network pharmacology; Buyang Huanwu Decoction; Alzheimer′s disease; Target; Apolipoprotein E

阿爾茨海默?。ˋD）是一種極大影響患者、家庭的重大社會問題[1-6]。常規(guī)的臨床診斷大多采用通過咨詢患者病史和認知能力測試，但這些方法具有較低的敏感性和特異性，并只有在患者死亡后通過解剖發(fā)現疾病過程的物理證據時，才有可能作出明確的診斷。然而，當患者的體征和癥狀可以明確診斷時，其腦病理學往往相當嚴重，這極大地影響和延誤了患者的病情及康復。目前，針對AD的治療藥物很多，但大多有明顯的毒副作用，如現階段唯一獲準用于AD主要治療藥物的乙酰膽堿酯酶抑制劑（ACHEⅠ），不適用于心動過緩及低血壓患者。因此，治療AD的有效和副作用小的藥物亟待發(fā)現。

中醫(yī)理論認為，氣為血之帥，血為氣之母，治風先治血，血行風自滅。氣虛血瘀是缺血性腦血管病發(fā)生的主要病機，外感邪氣或臟腑功能失調，氣血運巧不暢。血不達于腦，正氣虧虛，氣虛推動無力，產生血疲，兩者互為因果，病情纏綿難愈。益氣活血的代表方劑補陽還五湯在臨床作為防治缺血性中風重要藥物，一直被廣泛應用。但明確的基于補陽還五湯治療缺血性中風的體內作用靶標及機制尚不可知，本實驗采用網絡藥理學方法，從方劑所含成分入手，根據藥物分子的理論對接靶標預測補陽還五湯的直接作用成分，為實驗研究和臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMID中藥系統藥理學技術平臺（http：//www.megabionet.org/tcmid/）;BATMAN-TCM平臺（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）;ChemBioOffice 2014綜合性科學應用軟件包（CambridgeSoft公司，美國），PharmMapper反向藥效團匹配數據庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）;STRING 10.5功能蛋白的關聯網絡數據庫（https：//string-db.org/）;UniProt蛋白質生物功能數據庫（http：//www.Uniprot.org/）;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因與基因組百科全書（http：//www.Genome.jp/kegg/）;DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）;MAS 3.0生物分子功能注釋系統（http：//mas.capitalbiotech.com/mas3/）;Cytoscape 3.5.1數據可視化軟件（http：//cytoscape.org/）。

1.2 方法

1.2.1 構建補陽還五湯化學成分數據庫? 通過TCMID數據庫和美國國家醫(yī)學圖書館PubMed數據庫檢索補陽還五湯中所含化學成分[7-13]，特別是口服補陽還五湯后入血成分[14]，構建補陽還五湯所含化學成分數據庫。

1.2.2 靶點預測及篩選? 基于補陽還五湯的化學成分，BATMAN-TCM數據平臺對補陽還五湯所含化學成分進行化合物-作用靶標預測，并設定閾值收錄分子對接打分最高的前10個靶點用于下一步靶點及藥物作用網絡分析;將補陽還五湯中所含的143個化學成分全部帶入ChemBioOffice 2014軟件，用于生成具有化學物3D結構的mol2文件，并將其分別帶入PharmMapper反向藥效團匹配數據庫，根據空間結構預測與其對接不同程度的作用靶點;同時將上述143個化合物帶入STRING 10.5功能蛋白的關聯網絡數據庫預測藥物靶點。最后將上述結果進行匯總全部輸入蛋白質生物功能數據庫（UniProt），將其校正為官方名稱。

1.2.3 通路獲取及生物機制分析? 將獲取的所有靶點編號帶入MAS 3.0數據庫，通過對基因、mRNA、蛋白、通路、協同調節(jié)基因、疾病、相互作用、miRNA等多方面綜合分析，最終獲取關于補陽還五湯關于作用靶點的整合數據。

1.2.4 網絡構建及補陽還五湯防治AD的作用機制分析? 將上述初篩靶標帶入DAVID數據庫進行功能和通路富集，選擇P < 0.05，且與AD相關的基因本體術語（Gene ontology term）、KEGG通路（KEGG pathway）、孟德爾人類遺傳/治療靶數據庫（OMIM/TTD disease）。富集并聚焦核心通路及靶點。最終通過Cytoscape 3.5.1軟件的Network Analyzer插件分析及構建靶點的代謝網絡。

2 結果

2.1 補陽還五湯所含化學成分結果

通過TCMSP及BATMAN-TCM數據平臺及文獻檢索整合獲取補陽還五湯中160個化合物，其中與預防AD密切相關的成分有16個，分別是香芹酚、1-十六碳烯、乙酸亞油醇、藏花醛、新辛烯、3-己醇、甜菜堿、苯乙醛、3，5-二甲氧基二苯乙烯、膽堿、1-十七碳烯、2-己醇、丹皮酚、花生酸、乙酸、刀豆氨酸。與AD發(fā)生發(fā)展密切相關的主要靶標有10個，分別是載脂蛋白E、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、緩激肽B2、羧酸酯酶1、煙堿型乙酰膽堿受體B2、內皮素轉換酶1、犬尿氨酸酶、神經生長因子受體、前列素內環(huán)氧化物合成酶2。見表1。

2.2 補陽還五湯潛在靶點代謝通路結果

整合上述數據處理過程及相關數據庫檢索結果，匯總補陽還五湯代謝通路結果。見表2。

2.3 網絡構建和分析

最后利用Cytoscape 3.5.1軟件進行處理，得到補陽還五湯“結構類型-化合物-蛋白靶點-通路-病理過程”的成分靶標互作圖。補陽還五湯中含有的1-十六碳烯、1-十七碳烯和新辛烯。

3 討論

通過對網絡中各化合物作用通路具體信息分析發(fā)現載脂蛋白E（ApoE）與AD的發(fā)病機制有密切相關性[15-20]。ApoE是一種血漿蛋白，由229個氨基酸組成，與脂肪結合及膽固醇類物質的轉運相關。其主要的合成和分泌場所是肝臟，其次是大腦。現代研究表明ApoE直接促進了疏水性淀粉樣β（Aβ）沉淀的形成?？梢酝ㄟ^加入純化后的ApoE來控制Aβ發(fā)生聚集的相對速度和聚集程度。ApoE多態(tài)性等位基因是AD風險的主要遺傳決定因素：攜帶ε4等位基因的個體與攜帶較常見ε3等位基因的個體比較，患AD的風險增加，而ε2等位基因則降低風險。ApoE ε4等位基因的存在還與正常老化期間腦淀粉樣血管病的風險增加和與年齡相關的認知能力下降有關。載脂蛋白與多種細胞表面受體結合，傳遞脂質，還與Aβ肽結合，引發(fā)毒性事件，導致AD的突觸功能障礙和神經變性。在大腦中，載脂蛋白在調節(jié)腦脂質轉運、葡萄糖代謝、神經元信號傳導、神經炎癥和線粒體功能方面具有明顯的功能。神經退行性疾病AD的特征是存在β-淀粉樣蛋白（Aβ）病理和Tau病理。罕見的AD病例由常染色體顯性突變引起，但大多數患者有散發(fā)性AD。導致散發(fā)性AD的途徑可能是多種多樣的，并且根據患者是否攜帶載脂蛋白，疾病途徑可能不同。葉黃素ApoE ε4是AD的主要遺傳風險因子，并且可能促進Aβ的積累，觸發(fā)導致Tau病理學擴散、突觸功能障礙、萎縮和認知能力下降的級聯反應。30%～40%的散發(fā)性AD癡呆患者是ApoE ε4陰性，這些患者可能主要有非遺忘性認知障礙等現象，與ApoE ε4陽性AD患者比較，以往對AD中ApoE ε4的研究由于缺乏對AD診斷的Aβ-生物標志物確認而受到限制，這使得患者有可能被納入AD的假陽性診斷研究中。目前，關于ApoE ε4在前驅性AD中的作用研究較少，無論在臨床實踐中還是在藥物開發(fā)中，前驅性AD都是一個日益重要的疾病階段。因此如何靶向性的針對ApoE來設計是治療AD的有效策略。

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（收稿日期：2018-10-06? 本文編輯：封? ?華）