建立ELISA法檢測胸膜液GSDMD及其對胸腔積液鑒別診斷的價值①

史 靜 袁 源 陳 紅 周麗菁 甘德露 陳維賢 李 樸

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400042）

胸腔積液（pleural effusion，PE）是以胸膜腔內(nèi)病理性液體積聚為特征的一種常見臨床癥候，當(dāng)患者全身狀況、肺部疾病、器官功能障礙等病理過程導(dǎo)致胸膜液形成和吸收不平衡時通常會產(chǎn)生PE。結(jié)核性肺炎、肺部感染和惡性肺部疾病是PE最常見的原因［1］。臨床檢驗工作中常采用病原菌檢測、生化和免疫分析PE 以區(qū)分其病因。對于結(jié)核性PE，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）涂片染色法是目前確診Mtb的金標(biāo)準(zhǔn)，但敏感度有限，培養(yǎng)Mtb 需數(shù)周時間，且需要較高的實驗室條件。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與類肺炎性PE、結(jié)核性胸膜炎或惡性PE 有關(guān)，故LDH 在鑒別PE 病因方面缺乏特異性和敏感度［2］。一份針對63 項研究的Meta 分析結(jié)果顯示，腺苷脫氨酶（adenosine eaminase，ADA）診斷結(jié)核性胸膜炎平均敏感度和特異性分別為0.92 和0.90［3］。但最近一項研究發(fā)現(xiàn)，ADA 水平雖然在胸膜結(jié)核診斷中效率較高，但在結(jié)核組和惡性組鑒別診斷中可能無明顯作用［4］。且ADA在低患病率環(huán)境下的診斷效果不理想［5］。故探索更經(jīng)濟(jì)、高效和檢測方法可行的生物標(biāo)志物尤其重要。

焦亡（pyroptosis）是一種由caspase-1 或caspase-11/4/5 激活的炎癥性程序性細(xì)胞死亡途徑［5］。Gasdermin——焦孔素（包括6 個同源基因GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、PJVK）是一個具有成孔效應(yīng)的蛋白家族，可影響膜通透性和細(xì)胞焦亡。目前研究表明，GSDMD 是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者。GSDMD 被激活的caspase 切割，產(chǎn)生1 個GSDMD-N端片段和1 個GSDMD-C 端調(diào)控域。GSDMD-N 在焦亡過程中寡聚并插入細(xì)胞膜，形成氣孔，最終導(dǎo)致焦亡［6-7］。此外，還存在一種鈣依賴的膜修復(fù)反應(yīng)，由轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting com‐plexes required for transport Ⅲ，ESCRTⅢ）介導(dǎo)，通過去除GSDMD 膜孔維持細(xì)胞膜完整性，從而抑制細(xì)胞滲透性裂解［8］。如果這一機(jī)制是抑制GSDMD 膜孔介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的一種常見反應(yīng)，那么無細(xì)胞的上清中可能含有GSDMD，為GSDMD 作為一種新的胞外炎癥性體液生物標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)［9］。

目前PE 中GSDMD 的定量檢測尚未見報道，GSDMD 水平與PE 相關(guān)疾病的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究旨在通過建立臨床常用的ELISA檢測法，探討胸膜液中GSDMD 用于鑒別胸膜液病因的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2018 年10 月至2019 年11 月于呼吸內(nèi)科就診的患者161 例，包括漏出性PE 30 例（對照組）、結(jié)核性PE 40 例（結(jié)核組）、惡性PE 48 例（惡性組）、感染性PE 43 例（感染組）。結(jié)核性胸膜炎中的結(jié)核病診斷和治療根據(jù)《全球結(jié)核病報告》指南診斷。惡性組取自非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，遵循國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)發(fā)布的診療指南診斷和治療。本研究不包括合并肺癌和結(jié)核性肺炎患者。感染組患者標(biāo)準(zhǔn)：①滲出物與細(xì)菌性肺炎、肺膿腫或支氣管擴(kuò)張有關(guān)；②以炎癥性胸膜炎、慢性膿胸或胸膜纖維化、斑塊為表現(xiàn)，胸膜液未見Mtb者。不屬于上述任何一種類型的滲出性PE歸入“漏出性”組。本研究按照《赫爾辛基宣言》原則進(jìn)行，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程采集PE，并立即轉(zhuǎn)入臨床試驗室。取胸膜液室溫15 000 r/min 離心10 min，收集上清，?80 ℃保存待檢。本研究受試者臨床特征見表1。

表1 PE患者生化和細(xì)胞學(xué)特征（±s）Tab.1 Biochemical and cytological characteristics in PE patients（±s）

表1 PE患者生化和細(xì)胞學(xué)特征（±s）Tab.1 Biochemical and cytological characteristics in PE patients（±s）

Characteristics n Male/Female Age/year GSDMD/（ng·ml?1）LDH/（U·L?1）ADA/（U·L?1）Tuberculosis（TPE）40 23/17 54.77±12.64 45.56±24.57 395.40±283.92 40.34±16.61 Malignant（MPE）48 26/22 63.66±10.03 24.43±16.31 381.26±292.34 17.03±9.68 Infection（PPE）43 23/20 54.09±12.29 26.27±17.79 183.26±71.09 14.68±7.04 Control 30 18/12 56.70±11.54 5.50±4.28 217.47±159.58 7.15±4.16

1.1.2 試劑與儀器 GSDMD 單克隆抗體、HRP 酶標(biāo)抗體（兔抗人免疫球蛋白IgG 抗體，美國Abcam）；Corning 96孔酶標(biāo)板（美國Thermo Fisher Scientific）；ELISA 試劑盒（北京萬泰）；ADA 和LDH 檢測試劑盒（四川Maccura）；MultiskanTMFC 微平板閱讀器（美國Thermo Scientific）；7600 自動生化分析儀（日本日立）；IMMULITE?1000 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國西門子）。

1.2 方法

1.2.1 GSDMD ELISA 檢測法建立 采用單項滴定法確定酶標(biāo)板上包被抗體濃度，將抗GSDMD 單克隆抗體梯度稀釋，以陽性參考品和陰性參考品代替樣本，測定OD 值。陽性參考品OD 值>1.0，陰性參考品OD<0.2 為包被最適濃度。100μl 最適濃度的抗GSDMD 單克隆抗體4 ℃包被過夜，次日甩干洗滌后加入5%脫脂牛奶250 μl 封閉，將待測樣本加至孔中37 ℃孵育2 h，甩干，含0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌5 次，加入抗GSDMD 多克隆抗體37 ℃孵育1 h，甩干，PBST洗滌3次，每次浸泡2 min，再加入HRP酶標(biāo)抗體（兔抗人免疫球蛋白IgG）37 ℃孵育30 min，拍干洗板，加入底物TMB 100 μl 37 ℃孵育15 min，加入50 μl 終止液（1 mol/L H2SO4），5 min 內(nèi)采用MultiskanTMFC 微平板閱讀器測量450 nm 處OD值。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將商品化GSDMD 抗原標(biāo)準(zhǔn)品（2 000 pg/ml）倍數(shù)稀釋，得到濃度為2 000~15.6 pg/ml 的一系列標(biāo)準(zhǔn)品。各濃度標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測2 次，以超純水為空白孔樣本，OD 差值=實驗孔OD 值?空白對照孔OD 值，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)品GSDMD濃度和OD差值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 方法學(xué)評價 重復(fù)性試驗：取濃度分別為500、250、125、62.5、31.2 pg/ml 的5 個標(biāo)準(zhǔn)品，批內(nèi)變異系數(shù)采用同批酶標(biāo)板測定5 次；批間變異系數(shù)采用3 批不同時間包被的酶標(biāo)板測量5 次。干擾試驗：隨機(jī)選擇5 份陽性無溶血和黃疸GSDMD 樣本，加入一定量（1.2、2.4 和4.8 g/L）血紅蛋白和（70、140 和280 μmol/L）膽紅素，再次檢測GSDMD濃度，進(jìn)行配對檢驗，Graphpad Prism 5.0 軟件繪制柱狀圖。

1.2.4 胸膜液指標(biāo)檢測 采用ELISA 試劑盒按照制造商說明檢測IFN-γ水平。7600自動生化分析儀檢測ADA 和LDH 活性，IMMULITE?1000 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測IL-1β水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 ELISA 方法學(xué)評價包括線性范圍、檢測限確定、批內(nèi)和批間變異系數(shù)及干擾試驗。采用SPSS20.0 軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以±s表示，比較采用t檢驗，兩組間比較采用單因素方差分析。本研究所有檢驗均為雙尾，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GSDMD、LDH、ADA 及3 種生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確性采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價，計算特異性、敏感度和曲線下面積（area under the curve，AUC），濃度臨界值（cut-off）以最大約登指數(shù)計算［10］。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 法檢測GSDMD 方法學(xué)建立和評價 當(dāng)包被抗體濃度為1μg/ml時為最適包被濃度（此時陽性參考品OD>1.0，陰性參考品OD<0.2）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000、1 500 和2 000 pg/ml）的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD 差值為縱坐標(biāo)，繪制濃度與OD 差值曲線（圖1A）。當(dāng)GSDMD 濃度為31.2~250 pg/ml 或250~2 000 pg/ml時，OD 差值接近線性，分別對以上GSDMD 標(biāo)準(zhǔn)濃度的自然對數(shù)和OD差值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1B）。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：①y=0.036 8x+0.041 9（31.2~250 pg/ml，R2=0.954 1），x=ln（X）；②y=0.292 8x?1.388 6（250~2 000 pg/ml，R2=0.996 6），x=ln（X）。其檢測限為31.2 pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5.65%和8.63%（表2）?？垢蓴_能力評價：濃度膽紅素（280 μmol/L）和血紅蛋白（4.8 g/L）干擾下，GSDMD濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

表2 批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗Tab.2 Intra-batch and inter-batch repeatability

圖1 GSDMD 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)與OD 差值曲線圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Difference curve and standard curve between natural logarithm and OD of GSDMD standard substance concentration

圖2 膽紅素（A）和血紅蛋白（B）干擾實驗Fig.2 Bilirubin（A）and hemoglobin（B）interference ex?periments

2.2 PE 中GSDMD、ADA 與LDH 表達(dá)的相關(guān)性分析 本研究檢測患者PE 標(biāo)本中GSDMD、ADA 和LDH 水平，并對其含量進(jìn)行相關(guān)性分析。包含所有患者時，3 個生物標(biāo)志物差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PE 中GSDMD 含量與ADA 呈正相關(guān)（r=0.389 8，P<0.001，圖3）。

圖3 相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis

2.3 GSDMD 對不同類型PE 的鑒別診斷價值 結(jié)核組、惡性組、感染組和對照組GSDMD 濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.000 1，圖4）。GSDMD 在區(qū)分漏出性PE 和惡性PE（AUC=0.947）、結(jié)核性PE（AUC=0.998）及感染性PE（AUC=0.951）中具有較高診斷能力，而ADA AUC 分別為0.874、0.945 和0.826，LDH AUC為0.716、0.794和0.524。GSDMD鑒別漏出性PE 和結(jié)核性PE 的AUC 水平最高，cut-off值為16.007 ng/ml，靈敏度為100.0%，特異度為96.7%。與ADA 和LDH 相比，GSDMD 在鑒別滲出性PE 與惡性PE、結(jié)核性PE 和感染性PE 的診斷靈敏度最高。在鑒別結(jié)核性PE 與惡性PE 時，相比于GSDMD（AUC=0.835），ADA的診斷性能略高（AUC=0.845）。在惡性組與感染組、結(jié)核組與感染組及結(jié)核組與惡性組中的鑒別診斷性能，ADA 和LDH 優(yōu)于GSDMD（表3）。

圖4 各組GSDMD、ADA和LDH表達(dá)及診斷效能Fig.4 GSDMD，ADA and LDH expressions and diagnosis in each group

表3 生物標(biāo)志物鑒別PE的AUC值Tab.3 Value of AUC of biomarkers for PE antidiastole

2.4 GSDMD、ADA 和LDH 聯(lián)合檢測對PE 鑒別診斷的價值 GSDMD、ADA 和LDH 聯(lián)合檢測結(jié)果顯示，其在對照組與惡性組（AUC=0.953）、對照組與感染組（AUC=0.987）、結(jié)核組與惡性組（AUC=0.915）具有更高鑒別診斷能力（表4）。3種指標(biāo)聯(lián)用時診斷特異性和敏感度均高于單一生物標(biāo)志物。

表4 GSDMD、ADA、LDH聯(lián)合鑒別診斷PE的效能Tab.4 Diagnostic value of combined detection of GSD?MD，ADA and LDH for PE antidiastole

3 討論

焦亡是一種病理原因?qū)е碌囊蕾囉赾aspase 的細(xì)胞死亡類型，以磷脂酰絲氨酸接觸、孔形成、細(xì)胞膜破裂、胞質(zhì)內(nèi)容物分泌（包括IL-1β、LDH和IL-18）為特點［7］。近年多項研究表明，不同病理刺激，如感染性疾病（包括普通細(xì)菌及Mtb、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等）均可引起焦亡［9-16］。焦亡主要發(fā)生于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)溶解性細(xì)胞死亡［17］。近期研究顯示，一種鈣依賴的膜修復(fù)機(jī)制——ESCRTⅢ可拮抗焦亡［8］。作為進(jìn)化上保守的觸發(fā)細(xì)胞膜修復(fù)的機(jī)制，鈣通量通過溶酶體等囊泡胞吐、膜附件蛋白動員及ESCRT 機(jī)制修復(fù)細(xì)胞膜損傷［18］。基于這一膜修復(fù)機(jī)制，無細(xì)胞培養(yǎng)上清中將檢測到GSDMD［6］。此外，焦亡是一種細(xì)胞溶解性死亡方式，細(xì)胞膜破裂后，GSDMD 可能大量釋放。以上研究為PE 可檢出GSDMD提供了理論依據(jù)。

GSDMD-N結(jié)構(gòu)域?qū)е碌目紫稌鸺?xì)胞焦亡，但也會產(chǎn)生超活性細(xì)胞，其GSDMD 孔隙數(shù)少于焦亡細(xì)胞［19］。焦亡過程中，細(xì)胞膜破裂、胞質(zhì)蛋白釋放、超活性細(xì)胞亦會釋放胞質(zhì)蛋白。已有研究證實，孔隙形成蛋白GSDMD 可調(diào)節(jié)過度活躍的巨噬細(xì)胞釋放IL-1，提示GSDMD可能成為比其他炎癥性生物標(biāo)志物敏感度更高的指標(biāo)［20-24］。近年越來越多的生物標(biāo)志物被用于PE 鑒別診斷，如IL-27 用于結(jié)核性PE 診斷的靈敏度為96.1%，CXCL9 為97.7%，CXCL11 為95.4%，以及新型生物標(biāo)志物CD44等［22-24］。而GSDMD 用于診斷結(jié)核性PE 的靈敏度高達(dá)100%，在PE早期診斷中起不可或缺的作用。

本研究觀察到GSDMD 在不同病理條件下伴有不同程度升高，GSDMD 鑒別漏出性PE 和其他病理性PE 的AUC 值均>0.94。GSDMD AUC 平均值為0.965，而ADA為0.882，LDH為0.678?？梢奊SDMD在鑒別漏出性PE和其他病理性PE方面的診斷效能高于ADA 和LDH。GSDMD 區(qū)分漏出性PE 和結(jié)核性PE 的敏感度和特異性分別為100.0%和96.7%（AUC=0.990），cut-off 值為16.007 ng/ml。GSDMD不僅在結(jié)核性PE鑒別診斷方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，且在結(jié)核性PE 和惡性PE 鑒別（AUC=0.835）、結(jié)核性PE 和感染性PE 鑒別（AUC=0.806）中也表現(xiàn)良好。本研究也依據(jù)最高的診斷準(zhǔn)確率計算了GSDMD 的cut-off 值。雖然GSDMD 在PE 鑒別診斷中還存在一些不足，如惡性PE 與感染性PE 鑒別、結(jié)核性PE 與感染性PE鑒別，但GSDMD仍具有良好的診斷性能，且GSDMD、ADA 和LDH 3 種指標(biāo)聯(lián)用進(jìn)一步提高了診斷能力。

本研究建立的GSDMD ELISA 法最低檢出限可達(dá)到31.5 pg/ml，抗血紅蛋白（4.8 g/L）和膽紅素（280μmol/L）干擾性較好。低濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性不理想（R2=0.954 1），批間變異系數(shù)較大（15.1%），可能是ELISA 檢測易受干擾所致，需更多研究探索更好的檢測條件或其他更穩(wěn)定靈敏的檢測方法?？傊捎瞄g接雙抗夾心ELISA 法檢測PE GSDMD，簡單易行，靈敏度高，線性范圍廣，可在一般醫(yī)院開展。

本研究仍有一些局限性。首先，納入人群有限，可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚。此外，很難排除PE 的誤分類，尤其是漏出性PE 和感染性PE。同時PE 采集仍是一種有創(chuàng)檢測，血清正常GSDMD 水平有待進(jìn)一步明確。

綜上，本研究建立了ELISA定量檢測PE GSDMD的方法，并探討了GSDMD 在不同類型PE（包括漏出性、結(jié)核性、惡性和感染性PE）鑒別診斷中的臨床價值。GSDMD 濃度不僅可作為一種新的PE鑒別診斷生物標(biāo)志物，具有較高診斷敏感度，且可與ADA 和LDH結(jié)合進(jìn)一步提高診斷能力。