N-乙?；讲f唑啉酮及金屬配合物的合成、生物活性和分子對(duì)接研究

楊丹，羅富璀，楊穎婷，劉闖，朱華玲，呂麗娟

（天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384）

尋找植物源抗菌、殺蟲或除草化合物一直是國(guó)際植物保護(hù)，尤其是新農(nóng)藥研究開發(fā)中被廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。作為植物次生物質(zhì)的一種，苯并噁唑啉酮化合物具有顯著的抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗HIV[4]、抗菌殺菌[5]以及褪黑素受體拮抗[6]等生物活性，在植物自我防御中起著重要的作用[7]，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等方面[8]。以苯并噁唑酮為母體，開發(fā)研究新的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物具有十分重要的意義[9]，目前的研究已發(fā)現(xiàn)一些苯并噁唑酮衍生物有殺菌、除草和殺蟲活性，以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和昆蟲拒食作用[10]。但關(guān)于苯并噁唑酮的金屬配合物研究還較少。本文主要合成了3種未見文獻(xiàn)報(bào)道的乙酰基苯并噁唑酮金屬配合物，并對(duì)合成的化合物進(jìn)行了抑菌和除草活性測(cè)試，進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接方法研究了合成化合物與原卟啉原氧化酶的相互作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品

美國(guó)Bruker公司400 MHz型核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，DMF-d為溶劑）；FTIR-850型傅里葉變換紅外光譜儀；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)；CHN CORDER MF-3型元素分析儀；DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋；WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀；LRH-250-S電熱恒溫培養(yǎng)箱。

苯并噁唑啉酮購(gòu)自成都貝斯特試劑有限公司；乙酰氯購(gòu)自天津江天統(tǒng)一化學(xué)試劑有限公司；醋酸鋅購(gòu)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；醋酸銅購(gòu)自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；醋酸鎳購(gòu)自天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 N-乙?；讲哼蜻暮铣?/h3>

取苯并噁唑啉酮0.01 mol（1.35 g），三乙胺0.015 mol（1.52 g），加入50 mL 二氯甲烷，攪拌使其充分溶解，冰浴到0 ℃，緩慢滴加溶有0.012 mol乙酰氯的二氯甲烷溶液20 mL，大約1 h滴完，0 ℃下攪拌反應(yīng)30 min。反應(yīng)液用30 mL飽和氯化鈉水洗滌2次，有機(jī)層經(jīng)無(wú)水氯化鈣干燥，除去溶劑。無(wú)水乙醇重結(jié)晶得淺黃色片狀晶體，mp：（139±1）℃；IR（KBr）ν：3 441（w），3 125（w），3 044（w），2 938（w），1 816（s），1 726（s），1 602（m），1 479（s），1 377（s），1 317（s），1 254（m），1 151（s），1 024（s），922（w），746（s） cm-1；UV：245（2.6），256（1.4），270（0.8）。

1.3 N-乙酰基苯并惡唑啉酮金屬配合物的合成

按照摩爾比1∶2稱取醋酸鋅和N-乙?；讲f唑啉酮，微熱使之分別溶于50 mL無(wú)水乙醇中。攪拌下將N-乙?；讲f唑啉酮溶液緩慢滴入醋酸鋅溶液中，回流3 h，溶液變渾濁，除去大部分溶劑，析出白色固體，過(guò)濾，真空干燥。用相同方法合成N-乙?；讲f唑啉酮的銅、鎳配合物，分別得到棕色固體和淺綠色固體。所得化合物的部分物理數(shù)據(jù)如下。

N-乙?；讲f唑啉酮合鋅，mp：（243±1）℃; IR（KBr）ν：3 400（w），3 064（w），2 987（w），1 761（m），1 668（s），1 599（s），1 551（s），1 472（s），1 452（s），1 331（m），1 259（s），1 009（s），955（w），771（w），741（w），694（m），518（m） cm-1；UV：245（3.0），256（1.3），273（0.1）。

N-乙?；讲f唑啉酮合銅，mp：（87±1）℃; IR（KBr）ν：3 401（w），3 062（w），2 983（w），1 762（m），1 655（s），1615（s），1 596（m），1 532（s），1 472（s），1 417（s），1 319（m），1 259（s），1 165（w），1 054（w），766（s），514（m） cm-1；UV：242（1.2），256（1.4），276（0.3）。

N-乙?；讲f唑啉酮合鎳，mp：≥320 ℃;IR（KBr）ν：3 429（w），3 014（w），2 938（w），1 718（s），1 683（s），1 610（m），1 448（s），1 384（s），1 341（s），1 257（m），1 151（s），1 034（s），942（w），682（s），514（m）cm-1；UV：247（1.8），256（0.8），276（0.2）。

1.4 抑菌活性測(cè)定

將化合物分別配成質(zhì)量濃度為5.00、2.50、1.25 mg/mL 的DMF溶液，以DMF做空白對(duì)照，采用單片紙碟法于37 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，通過(guò)測(cè)定抑菌圈的大小來(lái)反映化合物抑菌能力的高低。

1.5 除草活性測(cè)定

用平皿法測(cè)定合成化合物對(duì)小麥、油菜、稗草的抑制活性[11]。稱取N-乙?；讲f唑啉酮合鋅、N-乙酰基苯并噁唑啉酮合銅、N-乙?；讲f唑啉酮合鎳各0.005 g，分別加入2 mL DMF溶液使其全部溶解，然后用蒸餾水將其定容至50 mL，配成濃度為100 μg/mL的藥液，將其經(jīng)2次成倍稀釋，最終配成100、50、25 μg/mL的藥液，以同濃度DMF水溶液做對(duì)照試驗(yàn)。

取3個(gè)濃度的藥液各4 mL，加至墊有2 張大小一致的9 cm濾紙的培養(yǎng)皿中，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入顆粒均勻、剛露白的小麥、油菜、稗草種子各10 粒，將培養(yǎng)皿蓋上，在（27±1）℃下培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。計(jì)算平均值，并按下式計(jì)算抑制率。

抑制率（%）＝［（對(duì)照處理-藥劑處理）/對(duì)照處理］×100%

1.6 分子對(duì)接研究

配體分子準(zhǔn)備：根據(jù)結(jié)構(gòu)表征的結(jié)果確定合成配合物的結(jié)構(gòu)，利用Chemdraw繪制配合物的平面結(jié)構(gòu)，在Chem3D中轉(zhuǎn)換成3D構(gòu)象，再利用Autodock-tools 1.5.6[12]處理，使配體上可旋轉(zhuǎn)鍵在對(duì)接中可旋轉(zhuǎn)，形成晶體構(gòu)象，保存構(gòu)象文件，備用。

受體分子準(zhǔn)備：原卟啉原氧化酶（PPO）的三維構(gòu)象從http：//www.rcsb.org網(wǎng)站下載獲得，其蛋白質(zhì)PDB編碼為1SEZ[13]，用Autodock-tools 1.5.6軟件打開顯示PPO構(gòu)象，刪除構(gòu)象中的水分子配體，保存構(gòu)象文件，備用。

分子對(duì)接：采用拉馬克算法進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)配體和受體加極性氫和Gasteiger電荷，使用子程序AutoGrid進(jìn)行格點(diǎn)設(shè)置，運(yùn)用Autodock 4.2程序[14]進(jìn)行分子對(duì)接，采用拉馬克遺傳算法[15-18]搜索與活性位點(diǎn)匹配的10種可能配體對(duì)接構(gòu)象，對(duì)10種構(gòu)象進(jìn)行初步分析和篩選，綜合考慮能量越低越穩(wěn)定的原理及對(duì)接位點(diǎn)等因素，確定結(jié)合最有可能的構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的紅外、紫外表征分析

在N-乙?；讲f唑啉酮的紅外譜圖（表1）中，3 441 cm-1處的弱吸收峰屬于—OH伸縮振動(dòng)，這由互變異構(gòu)共存問(wèn)題引起；在3 125 cm-1處有吸收峰，屬于—NH伸縮振動(dòng)；在2 908 cm-1處有吸收峰，屬于飽和的C—H伸縮振動(dòng)；在1 817 cm-1和1 726 cm-1處各有1個(gè)吸收峰，分別屬于羰基、噁唑啉酮環(huán)羰基伸縮振動(dòng)；在1 603 cm-1處有吸收峰，屬于苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)；在1 317 cm-1處有吸收峰，屬于C—N（芳基碳）伸縮振動(dòng)；在765 cm-1處有吸收峰，屬于C—H（單取代）面外變形振動(dòng)；在660 cm-1處有吸收峰，屬于C—H（苯）面外伸縮振動(dòng)。

形成配合物后，—OH、羰基和酮羰基的伸縮吸收峰均向低波數(shù)移動(dòng)，此現(xiàn)象說(shuō)明N-乙酰基苯并噁唑啉酮配體的羰基和酮羰基均失去了原有的性質(zhì)，參與了配位反應(yīng)。同時(shí)，配合物在516～541 cm-1出現(xiàn)了新的M—O配位吸收峰，表明形成了配位鍵。

表1 N-乙?；讲哼蜻捌浣饘倥浜衔锏闹饕t外光譜數(shù)據(jù) cm-1

N-乙酰基苯并噁唑啉酮及金屬配合物的紫外圖中均出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，分別屬于苯環(huán)的π-π*躍遷、共軛體系的π-π*以及共軛體系的n-π*躍遷，這表明化合物分子內(nèi)存在大的共軛體系。當(dāng)N-乙酰基苯并噁唑啉酮配體與金屬離子配位后，其R帶吸收峰紅移，說(shuō)明配位后配體的共軛作用減弱，是電子向金屬離子轉(zhuǎn)移所致。

2.2 抑菌活性

所得化合物對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌環(huán)直徑如表2所示。

表2 N-乙?；讲f唑啉酮金屬配合物的抑菌環(huán)直徑

從表2可以看出，配合物N-乙酰基苯并噁唑啉酮合銅與N-乙?；讲f唑啉酮合鋅對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，并且濃度越高，抑制能力越好，尤其是N-乙?；讲f唑啉酮合銅配合物在濃度為1.25 mg/mL時(shí)仍表現(xiàn)出高敏性，表明該金屬配合物有可能成為有效的廣譜抑菌劑，可作為重點(diǎn)關(guān)注目標(biāo)進(jìn)一步研究與考察。

2.3 除草活性

采用平皿法測(cè)定了合成配合物對(duì)小麥、油菜、稗草種子生長(zhǎng)的抑制率，如表3所示。

從表3可以看出，3種金屬配合物對(duì)小麥、油菜和稗草種子均有一定的抑制能力，且對(duì)單子葉植物小麥和稗草的抑制能力弱于對(duì)油菜的抑制能力，同時(shí)表現(xiàn)出濃度升高抑制能力增強(qiáng)的特點(diǎn)。在低濃度時(shí)，鋅配合物對(duì)稗草根表現(xiàn)出一定的助長(zhǎng)作用。尤其是鋅配合物對(duì)油菜根的抑制率、鎳配合物對(duì)油菜根和莖的抑制率幾乎都達(dá)到100%，且不隨濃度變化，表明這兩種化合物可作為雙子葉植物的生長(zhǎng)抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究和利用。

表3 N-乙酰基苯并噁唑啉酮金屬配合物的抑制率

2.4 分子對(duì)接研究

將3種金屬配合物分別與原卟啉原氧化酶受體分子進(jìn)行分子對(duì)接研究，所得配合物優(yōu)勢(shì)構(gòu)象中最穩(wěn)定構(gòu)象的活性中心殘基及對(duì)接作用力如圖1所示，對(duì)接能和抑制常數(shù)如表4所示。

圖1 乙酰基苯并噁唑酮金屬配合物與原卟啉原氧化酶對(duì)接最佳構(gòu)象的活性中心殘基及對(duì)接作用力

表4 金屬配合物分別與原卟啉原氧化酶對(duì)接能和抑制常數(shù)

從圖1可見，配合物與酶對(duì)接后活性中心附近有多個(gè)氨基酸殘基，其中疏水性殘基有:Leu369、Leu356、Phe392、Phe439、Gly175、Gly370、Ala174、Cys177、Leu473、Ser474、FAD；親水性殘基比較少，僅Thr176噁與苯并唑啉酮N原子之間可形成穩(wěn)定氫鍵，而且離子型殘基沒有，說(shuō)明配合物與受體之間的作用力主要為疏水和氫鍵作用。

雖然3種金屬配合物與原卟啉原氧化酶之間的對(duì)接作用力都是分子間作用力和氫鍵作用，但形成的氫鍵數(shù)量是不同的，銅配合物與原卟啉原氧化酶之間的氫鍵只有1個(gè)，而鎳配合物是2個(gè)，鋅配合物是3個(gè)，這也決定了3種配合物對(duì)原卟啉原氧化酶的抑制能力是有差別的，形成的氫鍵數(shù)越多，抑制能力越好。

與表4中結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，形成氫鍵越多的化合物，其對(duì)接能越負(fù)，抑制常數(shù)越小。由表3中試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種配合物對(duì)小麥、油菜和稗草的抑制能力都比較強(qiáng)，并且彼此相差不大，這與分子對(duì)接研究的結(jié)論很相似，由此我們初步判斷乙?；讲f唑酮金屬配合物是通過(guò)抑制植物體內(nèi)原卟啉原氧化酶活性而發(fā)揮除草劑作用的，可將其看做是原卟啉原氧化酶抑制劑型化合物。

3 結(jié)論

本文合成了乙酰基苯并噁唑酮及銅、鎳和鋅的金屬配合物，對(duì)合成的配合物進(jìn)行了紅外、紫外等結(jié)構(gòu)表征，除草、抑菌活性測(cè)試和分子對(duì)接研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酰苯并噁唑啉酮合銅配合物具有明顯的抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的能力，有望開發(fā)成廣譜抗菌藥。3種配合物對(duì)小麥、油菜和稗草都有明顯的抑制能力，特別是對(duì)油菜根的抑制能力尤為突出，接近100%，有開發(fā)成除草劑的潛在優(yōu)勢(shì)。分子對(duì)接的結(jié)果表明，3種配合物與原卟啉原氧化酶的對(duì)接能較低，抑制常數(shù)較小，3種配合物可能是通過(guò)抑制原卟啉原氧化酶的活性而表現(xiàn)出除草活性的。