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    玉米素滅菌方式和濃度對藍(lán)莓試管苗增殖的影響

    2019-04-08 01:31:08柴慈江王坤英張文文劉春鵬魏維鄒航
    關(guān)鍵詞:繁殖系數(shù)莖段藍(lán)莓

    柴慈江,王坤英,張文文,劉春鵬,魏維,鄒航

    (1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院,天津300384;2.天津市澤芃農(nóng)業(yè)科技有限公司薊州區(qū)澤芃莊園藍(lán)莓種植基地,天津 301900)

    藍(lán)莓(blueberry)又名越桔、藍(lán)漿果,為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物,多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)外,還富含VE、VC和VA等維生素和果膠,特別是含有豐富的花青素、黃酮類及多酚類物質(zhì),這些物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化能力,可以改善人體內(nèi)部抗氧化環(huán)境,提高機(jī)體免疫能力。其中花青素在預(yù)防神經(jīng)元和心血管類疾病、糖尿病以及治療癌癥等方面起著重要作用,因此,藍(lán)莓具有良好的營養(yǎng)保健作用,可防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人的機(jī)體免疫能力、保護(hù)視力、提高記憶力水平、改善睡眠、強(qiáng)身健體等,被國際糧農(nóng)組織認(rèn)定為五大健康食品之一[1-3]。

    我國藍(lán)莓栽培起步較晚,但近年來發(fā)展很快,2008—2014年,藍(lán)莓產(chǎn)量以平均每年50.7%的速度遞增,2017年栽培面積達(dá)到31 210 hm2,總產(chǎn)量為114 905 t,預(yù)計到2026年,我國將超越北美成為全球第一藍(lán)莓生產(chǎn)國[4]。我國藍(lán)莓栽培的快速發(fā)展帶來藍(lán)莓苗木的大量需求,而組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)是滿足藍(lán)莓苗木需求的有效途徑。目前,我國藍(lán)莓組培快繁技術(shù)比較成熟,有的單位已經(jīng)具備了年產(chǎn)100萬苗木的生產(chǎn)能力[5]。

    試管苗的增殖培養(yǎng)是藍(lán)莓組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,玉米素(簡稱ZT)則是藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中使用最為普遍的植物激素。關(guān)于玉米素的滅菌方式,一些教科書中認(rèn)為玉米素在高溫下易于分解,應(yīng)該采用過濾滅菌方式滅菌[6-7],有的研究也明確提出玉米素采用了過濾滅菌的方式[8]。但有的研究中對玉米素的滅菌則采用了高溫滅菌方式[9-10],而大多數(shù)研究沒有明確述及玉米素的滅菌方式。過濾滅菌方式由于操作程序比較復(fù)雜,會給試管苗大規(guī)模繁殖中培養(yǎng)基的配制工作帶來不便。而高溫滅菌會對玉米素的作用產(chǎn)生多大影響,對此尚未見研究報道。此外,目前研究中關(guān)于玉米素的使用濃度也不盡一致。本文對玉米素的滅菌方式及使用濃度進(jìn)行了探討,以便為完善藍(lán)莓組培快繁技術(shù)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    以在含有ZT 1.0 mg/L的WPM培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的藍(lán)莓試管苗為試材,進(jìn)行下列2項試驗。

    1.1 ZT的滅菌方式對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖影響的研究

    以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中分別添加濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L的ZT,ZT的滅菌方式分為常規(guī)高溫滅菌和過濾滅菌兩種方式。

    高溫滅菌:將ZT加入培養(yǎng)基后與培養(yǎng)基在滅菌鍋中121 ℃保持16 min。

    過濾滅菌:先將未添加ZT的培養(yǎng)基在滅菌鍋中以121 ℃保持16 min進(jìn)行高溫滅菌,待培養(yǎng)基冷卻至40~50 ℃時,在超凈工作臺的無菌環(huán)境中將玉米素用過濾器過濾除菌,然后加入到培養(yǎng)基中。

    試驗共設(shè)5個處理:ZT 1.0 mg/L+高溫滅菌,ZT 2.0 mg/L+高溫滅菌,ZT 1.0 mg/L+過濾滅菌,ZT 2.0 mg/L+過濾滅菌,ZT 0 mg/L+高溫滅菌。各培養(yǎng)基的pH值均調(diào)至5.3,用8.0 g/L的瓊脂做固化劑。各個處理的培養(yǎng)基滅菌后,將‘公爵’‘北陸’‘愛國者’3個品種的藍(lán)莓試管苗莖段分別接種于各種培養(yǎng)基中,接種莖段長度為1.5~2.0 cm,每個品種每種處理接種3瓶,每瓶4個莖段,共12個莖段。

    上述各處理接種后,放在培養(yǎng)室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1 500~2 000 Lx,溫度23~28 ℃,光照時間14 h/d。培養(yǎng)40 d后,調(diào)查萌芽率、莖尖數(shù)、最大莖長及繁殖系數(shù)等各項指標(biāo),其中莖尖數(shù)為一個培養(yǎng)周期后的莖尖總數(shù),最大莖長為接種莖段新形成的分枝中最長分枝的長度,繁殖系數(shù)為接種莖段在一個培養(yǎng)周期后形成的可用于再接種的莖段數(shù)。用卡平方法對萌芽率做獨(dú)立性測驗,其他各項指標(biāo)按照完全隨機(jī)試驗單向分組資料的方法做方差分析,并用鄧肯氏新復(fù)極差法做多重比較。

    1.2 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖影響的研究

    以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中分別加入濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L的ZT,并加入蔗糖20 g/L,瓊脂8 g/L,pH調(diào)節(jié)至5.3,培養(yǎng)基分裝封口后,在滅菌鍋中進(jìn)行高溫滅菌(121 ℃,16 min)。培養(yǎng)基滅菌后,將‘藍(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個品種的藍(lán)莓試管苗莖段分別接種于各種培養(yǎng)基中,接種莖段長度1.5~2.0 cm,每個品種每種處理接種2瓶,每瓶5個莖段共10個莖段。

    上述各處理接種后,放在培養(yǎng)室培養(yǎng),培養(yǎng)條件同試驗1.1。培養(yǎng)40 d后,調(diào)查莖尖數(shù)、最大莖長及繁殖系數(shù)等各項指標(biāo),各項指標(biāo)的統(tǒng)計分析方法同試驗1.1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZT滅菌方式對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖的影響

    ZT不同滅菌方式各處理培養(yǎng)的藍(lán)莓試管苗萌芽及莖芽增殖情況見表1、表2。

    由表1可見,對于‘公爵’和‘愛國者’品種,所有添加ZT的處理的莖段中下部芽萌芽率、莖段頂部芽萌芽率及總萌芽率均顯著高于未添加ZT的處理,而且ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間無顯著差異。對于‘北陸’藍(lán)莓品種,各處理之間莖段頂部芽的萌芽率無顯著差異,但是添加ZT處理的莖段中下部芽的萌芽率顯著高于未添加ZT處理,除高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理外,其余各ZT處理的總萌芽率顯著高于未添加ZT處理。ZT濃度為2.0 mg/L時,高溫滅菌與過濾滅菌2個處理之間的莖段萌芽率無顯著差異,ZT濃度為1.0 mg/L時,過濾滅菌的莖段萌芽率顯著高于高溫滅菌。

    上述結(jié)果表明,對于‘公爵’和‘愛國者’2個藍(lán)莓品種,ZT濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時均可明顯促進(jìn)莖段萌芽率的提高,ZT的高溫滅菌和過濾滅菌對萌芽率的促進(jìn)效果無明顯差異。對于‘北陸’藍(lán)莓,ZT濃度為2.0 mg/L時,ZT的高溫滅菌和過濾滅菌對萌芽率的促進(jìn)效果無明顯差異。

    表1 ZT不同滅菌方式處理下藍(lán)莓試管苗的萌芽狀況

    由表2可見,對于‘公爵’,過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)與未添加ZT處理無顯著差異,但顯著低于高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理及其他添加ZT各處理;在最大莖長和繁殖系數(shù)上,添加ZT的各處理均顯著高于未添加ZT處理,ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間則差異不顯著。

    對于‘北陸’,高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著低于過濾滅菌處理,但是其最大莖長則顯著高于過濾滅菌的ZT 2.0 mg/L處理并與過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L無顯著差異。在繁殖系數(shù)上所有添加ZT的處理均顯著高于未添加ZT的處理,并且ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間無顯著差異。

    對于‘愛國者’,兩個高溫滅菌的ZT處理的莖尖數(shù)均顯著高于未添加ZT的處理,高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著高于過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L處理;在最大莖長和繁殖系數(shù)上添加ZT的各處理均顯著高于未添加ZT的處理,兩種滅菌方式之間差異不顯著。

    綜合上述,添加ZT可以明顯促進(jìn)藍(lán)莓莖段萌芽,并明顯增加繁殖系數(shù)。在ZT濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時,對ZT采用高溫滅菌和過濾滅菌對供試3個品種藍(lán)莓試管苗的繁殖系數(shù)的影響無明顯差異,因此,為簡化藍(lán)莓增殖培養(yǎng)基的配制工作,對ZT可以采用高溫滅菌的方法進(jìn)行滅菌。

    表2 ZT不同滅菌方式處理下藍(lán)莓試管苗莖芽增殖狀況

    供試3個品種藍(lán)莓試管苗在各處理中的生長狀況見圖1。

    圖1 不同ZT滅菌方式處理下3個品種藍(lán)莓試管苗生長狀況

    2.2 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖的影響

    不同ZT濃度試驗的結(jié)果見表3。

    表3 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)的影響

    由表3可見,對于‘藍(lán)豐’,ZT濃度在0.5~3.0 mg/L時各處理之間的莖尖數(shù)、最大莖長和繁殖系數(shù)等各項指標(biāo)均無顯著差異。

    對于‘北陸’,在ZT濃度0.5~3.0 mg/L范圍內(nèi),隨著ZT濃度增高,大致呈現(xiàn)出莖尖數(shù)增加而最大莖長下降的趨勢,繁殖系數(shù)的表現(xiàn)不規(guī)律,ZT濃度為0.5 mg/L的處理繁殖系數(shù)最高,并與ZT濃度3.0 mg/L的處理無顯著差異,但顯著高于ZT濃度1.0~2.0 mg/L的3個處理。

    對于‘愛國者’,ZT濃度為0.5 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著低于其他各處理,但其最大莖長顯著高于ZT濃度為3.0 mg/L處理并與其他處理無顯著差異,ZT濃度為0.5 mg/L處理的繁殖系數(shù)與ZT 1.0、1.5 mg/L兩個處理差異不顯著,但顯著高于ZT 2.0、3.0 mg/L兩個處理。

    綜上分析,對于供試的3個藍(lán)莓品種,雖然對ZT的反應(yīng)不盡一致,但是當(dāng)ZT濃度為0.5 mg/L時的繁殖系數(shù)均較高,且不低于其他各處理,繁殖系數(shù)分別達(dá)到6.3(‘藍(lán)豐’)、5.9(‘北陸’)和5.2(‘愛國者’),從降低成本和增殖培養(yǎng)效果兩方面考慮,ZT濃度為0.5 mg/L處理為這3個藍(lán)莓品種試管苗增殖培養(yǎng)的最佳處理。

    不同ZT濃度處理的藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)狀況見圖2。

    圖2 不同ZT濃度處理藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)狀況

    3 討論與小結(jié)

    玉米素是從甜玉米灌漿期的籽粒中提取并結(jié)晶出的第一個天然細(xì)胞分裂素,并且能夠人工合成。在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中,玉米素是使用最為普遍的細(xì)胞分裂素。通常認(rèn)為,玉米素在高溫下容易分解,因此在配制培養(yǎng)基時對玉米素應(yīng)該采取過濾滅菌方式滅菌[6-7]。陳鎮(zhèn)在其藍(lán)莓組織培養(yǎng)的研究中,在培養(yǎng)基配制時對玉米素就采用了過濾滅菌,并且當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時,布里吉塔藍(lán)莓品種的繁殖效率最高達(dá)到5.3[8]。過濾滅菌操作比較繁瑣,會對藍(lán)莓試管苗大規(guī)模繁殖中培養(yǎng)基配制工作帶來不便,影響工作效率。金如意等研究采用了將玉米素與培養(yǎng)基同時高溫滅菌的方法,結(jié)果表明當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時,藍(lán)莓叢生芽的數(shù)量增加1.82倍,所形成的嫩莖平均高達(dá)44.7 mm,獲得了較高的增殖效率[9]。尹利方等在對康維爾藍(lán)莓品種的研究中,也對玉米素連同培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌,當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時試管苗的增殖系數(shù)達(dá)到12.47[10]。這兩項研究結(jié)果表明,對玉米素進(jìn)行高溫滅菌是可行的。李俊明等在其編譯的《植物組織培養(yǎng)教程》中也認(rèn)為各種細(xì)胞分裂素都具有熱穩(wěn)定性[11]。本項結(jié)果中,當(dāng)玉米素濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時,無論對玉米素采用過濾滅菌還是高溫滅菌,均可以明顯促進(jìn)供試藍(lán)莓品種試管苗莖段的萌芽和增加繁殖系數(shù),且這兩種滅菌方式之間無顯著差異,表明高溫滅菌對玉米素的作用沒有明顯的不利影響,這一結(jié)果與金如意和尹利方等的研究結(jié)果基本一致。

    在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中,對于ZT的使用濃度的研究報道不盡一致。廉家盛等研究認(rèn)為,‘美登’藍(lán)莓在含有ZT 2.0 mg/L的B5培養(yǎng)基中繁殖系數(shù)最高[12]。楊艷敏等研究結(jié)果表明,‘斯巴坦’藍(lán)莓在ZT濃度為0.7 mg/L時增殖效果最好,‘伯克利’藍(lán)莓在ZT濃度為0.5 mg/L時增殖效果最好,而‘北陸’藍(lán)莓在ZT濃度為0.5 mg/L時增殖倍數(shù)最高,但苗較細(xì)弱[13]。李麗容等研究認(rèn)為,在含有ZT 2~3 mg/L的 WPM培養(yǎng)基上藍(lán)莓試管苗的增殖培養(yǎng)效果較好,繁殖系數(shù)大且生長健壯[14]。龔雪元等研究認(rèn)為,南高叢藍(lán)莓最佳增殖培養(yǎng)基為WPM+ZT 2.0 mg/L[15]。陶興魁等研究認(rèn)為,在含有ZT 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的改良WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的藍(lán)莓叢生芽最多[16]。張舵等研究認(rèn)為,‘斯巴坦’藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)基最佳激素配比為ZT 0.3 mg/L+I(xiàn)BA 0.2 mg/L,“北陸”藍(lán)莓最佳激素配比為ZT 0.3 mg/L+I(xiàn)BA 0.1 mg/L[17]。沙玉芬等研究認(rèn)為,‘杜克’藍(lán)莓試管苗最佳增殖培養(yǎng)基的ZT濃度為1.0 mg/L[18]。黃科等研究認(rèn)為‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓最佳增殖培養(yǎng)基CQWL+ZT 1.5 mg/L[19]。韓陽花研究表明,野生藍(lán)莓試管苗最佳的增殖培養(yǎng)基為含有ZT 1.0 mg/L的WPM培養(yǎng)基[20]。陳鎮(zhèn)研究認(rèn)為,‘布里吉塔’藍(lán)莓在WPM+ZT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中、‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓在AN+ZT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中均可以有效的繼代擴(kuò)增培養(yǎng)[8]。從目前的研究文獻(xiàn)看,在單純使用ZT的培養(yǎng)基中,ZT濃度的使用范圍大致在0.5~3.0 mg/L之間,變化較大。之所以產(chǎn)生這樣大的變化,可能與研究者使用的藍(lán)莓品種、基本培養(yǎng)基以及試材的生理狀態(tài)不同有關(guān)。陳鎮(zhèn)[8]和肖海峻等[21]的研究都表明,藍(lán)莓的不同品種之間在相同ZT濃度下的增殖效果存在明顯差異。因此,針對藍(lán)莓的不同品種研究其適宜的ZT濃度是必要的。本項研究中,‘藍(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個藍(lán)莓品種試管苗在含有ZT 0.5 mg/L的WPM培養(yǎng)基上的繁殖系數(shù)均表現(xiàn)較高,這一結(jié)果與陳鎮(zhèn)[8]和楊艷敏等[13]的研究基本一致。

    綜上認(rèn)為,在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中,玉米素的高溫滅菌(121 ℃下保持16 min)對藍(lán)莓試管苗增殖效果不會產(chǎn)生明顯的不利影響?!{(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個品種藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中,以采用WPM+ZT 0.5 mg/L的培養(yǎng)基為宜,培養(yǎng)效果較好,且成本較低。

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