苦參實(shí)毒性成分分析△

宿美鳳，雒曉梅，常曉燕，王小明，孫虹，李壯壯，石鉞*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

苦參Sophoraflavescens為豆科槐屬植物，傳統(tǒng)中藥苦參的藥用部位為根。近年來，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，中藥非藥用部位引起了越來越多的研究者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室整理發(fā)現(xiàn)，苦參實(shí)為豆科槐屬植物苦參的種子?！短票静荨氛麨榭鄥?shí)，至《本草綱目》標(biāo)明異名苦參子，可為藥用，性味苦寒，功能與主治：明目，健胃與驅(qū)蟲，善治急性菌痢，大便秘結(jié)等[1]。苦參實(shí)曾被收錄于1977版吉林省藥品標(biāo)準(zhǔn)[2]，《中醫(yī)驗(yàn)方集錦》和《中醫(yī)皮膚病學(xué)簡(jiǎn)編》記載苦參實(shí)用于治療肉疙瘩和青年扁平疣[3-4]，此外還有民間報(bào)道：王國(guó)栓將苦參實(shí)干燥粉碎裝入膠囊，臨床治療扁桃體炎患者41例，痢疾濕熱型18例，陰道滴蟲20例，均在服藥3～10 d治愈[5]。近年來對(duì)苦參實(shí)的研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道苦參實(shí)中含有高含量的生物堿類物質(zhì)和豐富的脂肪酸類物質(zhì)，并且苦參實(shí)脂肪酸提取物具有良好的抗氧化作用[6]。但是有文獻(xiàn)報(bào)道，一名男性患者由于痔瘡反復(fù)發(fā)作，自服苦參子仁20粒，當(dāng)晚發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，經(jīng)搶救康復(fù)[7]。因此本試驗(yàn)通過苦參實(shí)的單次給藥毒性試驗(yàn)對(duì)苦參實(shí)毒性成分進(jìn)行初步研究，為苦參實(shí)今后的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與試劑

藥材：苦參實(shí)購于內(nèi)蒙古赤峰，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定為豆科槐屬植物苦參Sophoraflavescens的成熟種子。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí) Wistar 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180±20 g，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào) SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所 SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(20～25 ℃，濕度40%～60%)，開展實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼喂一周，自由飲水進(jìn)食。

對(duì)照品：苦參堿(批號(hào)CHB-K-008)、氧化苦參堿(批號(hào)CHB-Y-053)、槐定堿(批號(hào)CHB-H-062)購自成都克洛瑪生物科技有限公司，槐果堿(批號(hào)MUST-17061205)購自成都曼斯特生物科技有限公司，氧化槐果堿(批號(hào)Z18S6B3547)購自上海源葉科技有限公司，N-甲基金雀花堿(批號(hào)J-032-161216)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。HPLC測(cè)定對(duì)照品純度均>98%。

試劑：95%乙醇購于北京化工廠。HPLC級(jí)乙腈購于Honeywell Burdick & Jackson公司。色譜級(jí)甲酸購于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。色譜級(jí)醋酸胺購于ROE SCIENTIFIC INC公司。娃哈哈純凈水購于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。001×7型陽離子交換樹脂購于天津南開大學(xué)化工廠。

對(duì)照品的配制：分別精密稱取苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿配制濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)配液，備用。

儀器：Agilent 1100 高效液相色譜儀，ES-1201-P 電子天平稱(1200 g，長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展公司)，Mettler Toledo AB135-S 型分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，KQ-250DE 超聲波清洗儀(中國(guó))，Eppendorf 移液器(德國(guó))。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參實(shí)總提取物的制備

苦參實(shí)適度粉碎(過20目篩)，95%乙醇水熱回流提取三次，每次1 h，過濾收集濾液，合并三次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，真空干燥既得苦參實(shí)提取物，備用。

2.2 苦參實(shí)提取物不同組分的制備

陽離子交換樹脂按照說明書進(jìn)行預(yù)處理，處理好的樹脂濕法裝柱(柱徑∶柱高=1∶8)，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得，取100 g苦參實(shí)提取物用酸水溶解少量多次，至酸水液無碘化鉍鉀反應(yīng)，酸水上樣吸附1～2 h，4倍柱體積去離子水洗脫至洗脫液近中性。再用14倍柱體積的5%氨性乙醇洗脫至洗脫液濃縮后無碘化鉍鉀反應(yīng)。分別將水洗部分和氨性乙醇洗脫部分減壓回收溶劑得到相應(yīng)的組分。

2.3 苦參實(shí)總提物單次給藥毒性試驗(yàn)

表1 苦參實(shí)總提物單次給藥毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 苦參實(shí)總提物單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果

表3 苦參實(shí)總提物單次給藥毒性試驗(yàn)雄性動(dòng)物體質(zhì)量的變化 g

表4 苦參實(shí)總提物單次給藥毒性試驗(yàn)對(duì)雌性動(dòng)物體質(zhì)量的影響 g

2.4 經(jīng)HPLC鑒定苦參實(shí)不同組分

2.4.1 供試品的配制 稱取2.1，2.2項(xiàng)下苦參實(shí)總提物及不同組分各自溶于50%甲醇水溶液中配制成10 mg·mL-1，渦旋超聲后，12 000 r·min-1離心10 min，取10 μL經(jīng)HPLC分析。

2.4.2 對(duì)照品的配制 取材料與試劑項(xiàng)下對(duì)照品母液，混合配制成混標(biāo)。

2.4.3 HPLC條件 液相條件：采用Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)和 10 mmol·L-1醋酸銨水溶液(B)；梯度洗脫條件：95%～83% B(0～6 min)，83% B(6～14 min)，83%～70% B(14～19 min)，70%～68% B(19～32 min)，68%～65%(32～35 min)，65%～0(35～40 min)，0～95%(40～43min)，95%(43～50 min)；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：室溫；色譜柱溫度：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm。

2.4.4 樣品分析 各組分色譜圖見圖1。由圖可知陽離子交換樹脂水洗部分為非生物堿部分，氨性乙醇洗脫部分與混標(biāo)色譜信息相匹配，所以氨性乙醇洗脫部分為生物堿部分。

注：A.混標(biāo)；B.苦參實(shí)總提物；C.生物堿部分；D.非生物堿部分。圖1 苦參實(shí)不同組分HPLC色譜圖

2.5 苦參實(shí)不同組分的單次給藥毒性試驗(yàn)

苦參實(shí)不同組分單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果見表5，體質(zhì)量變化見表6及表7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物堿組與總提物組出現(xiàn)動(dòng)物死亡，并且動(dòng)物出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象、癥狀以及體質(zhì)量變化均與2.3項(xiàng)下描述相似，死亡動(dòng)物進(jìn)行大體解剖無肉眼可見病變。而非生物堿組未出現(xiàn)死亡，無任何中毒癥狀，并且非生物堿組體質(zhì)量增長(zhǎng)與溶劑對(duì)照組相似。生物堿組與總提物組在給藥后1～3 d體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯緩慢而非生物堿組給藥后1～3 d體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。雖然生物堿組動(dòng)物死亡率低于總提物組，可以說明生物堿類物質(zhì)是引起苦參實(shí)急性毒性的主要原因。

表5 苦參實(shí)不同組分單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

通過本試驗(yàn)可知苦參實(shí)有毒，研究者通過對(duì)苦參實(shí)化學(xué)成分的文獻(xiàn)檢索分析，通過陽離子交換樹脂分離苦參實(shí)中的生物堿部分和非生物堿部分，并通過HPLC 驗(yàn)證陽離子交換樹脂可以將生物堿和非生物堿良好分離。

由試驗(yàn)結(jié)果可知苦參實(shí)的主要毒性成分為生物堿類物質(zhì)。

根據(jù)本試驗(yàn)所觀察到的急性毒性反應(yīng)癥狀，參照藥物單次給藥毒性研究指導(dǎo)原則中的一般觀察與指征，苦參實(shí)提取物引起的驚厥，肌肉震顫和強(qiáng)直性痙攣等毒性癥狀為神經(jīng)毒性癥狀。并且中毒癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道苦參、苦參堿和氧化苦參堿的急性毒性癥狀相似[9-11]。翁澤斌等[12]報(bào)道的山西產(chǎn)苦參種子生物堿類化學(xué)成分定性定量分析表明苦參實(shí)中含有大量生物堿類物質(zhì)，氧化苦參堿含量最高，本實(shí)驗(yàn)室也得到相似結(jié)論(待發(fā)表)。在中藥化學(xué)成分的研究過程中發(fā)現(xiàn)生物堿類物質(zhì)具有良好的藥理活性，同時(shí)如果大量使用也會(huì)產(chǎn)生毒性。現(xiàn)代研究表明，苦參中所含的生物堿類物質(zhì)是其主要的有效成分[13-14]。因此，也驗(yàn)證了本試驗(yàn)通過苦參實(shí)總提物單次給藥毒性試驗(yàn)以及苦參實(shí)的不同組分的單次給藥毒性試驗(yàn)得到的結(jié)果，引起苦參實(shí)急性毒性的主要原因?yàn)樯飰A類。但是從動(dòng)物死亡數(shù)可知，生物堿組引起死亡的動(dòng)物數(shù)低于總提物組，其產(chǎn)生原因可能是由于動(dòng)物個(gè)體差異、生物堿種類含量不同以及生物堿累積作用或者苦參實(shí)中含有其他非生物堿物質(zhì)對(duì)于苦參實(shí)中生物堿引起的毒性具有協(xié)同作用，也可能是其他原因，還有待深入研究。

表6 苦參實(shí)不同組分單次給藥毒性試驗(yàn)對(duì)雄性動(dòng)物體質(zhì)量的影響 g

表7 苦參實(shí)不同組分單次給藥毒性試驗(yàn)對(duì)雌性動(dòng)物體質(zhì)量的影響 g