膽南星中膽酸類成分含量測(cè)定及發(fā)酵前后含量比較△

劉曉峰，崔亞晨，單國(guó)順，許枬，高慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

膽南星為制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或?yàn)樯炷闲羌?xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成[1]。炮制能緩和天南星燥烈之性，降低毒性，轉(zhuǎn)變藥性，性由溫轉(zhuǎn)涼，味由辛轉(zhuǎn)苦，功能也由溫化寒痰轉(zhuǎn)為清化熱痰，即所謂相畏為制、生毒熟減、以寒制熱[2]。課題組通過市場(chǎng)及生產(chǎn)企業(yè)的走訪調(diào)研，了解到因?yàn)槿鄙傧鄳?yīng)的質(zhì)控指標(biāo)，膽南星發(fā)酵工藝不規(guī)范，發(fā)酵時(shí)間從24 h至數(shù)月不等，所用膽汁多為豬膽汁(或豬膽膏)，膽汁用量相差數(shù)倍，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，故急需建立膽南星的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，改善膽南星當(dāng)前所存在的一些問題[3]。

關(guān)于膽南星含量測(cè)定的方法有一些報(bào)道[3-7]，但因炮制機(jī)理不清，所選指標(biāo)未體現(xiàn)出與質(zhì)量控制的相關(guān)性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膽南星發(fā)酵后結(jié)合型膽酸轉(zhuǎn)化為游離型膽酸，如甘胺豬膽酸、?；秦i膽酸轉(zhuǎn)化為豬膽酸；甘胺豬去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸轉(zhuǎn)化為豬去氧膽酸；甘胺鵝去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸轉(zhuǎn)化為鵝去氧膽酸。因此足夠的發(fā)酵時(shí)間和充足膽汁量是幾種游離型膽酸含量的保證，本文建立豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸3個(gè)增量成分的含量測(cè)定方法，為膽南星發(fā)酵原理、工藝規(guī)范化研究提供參考。

1 材料

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀；奧泰2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MettLer AE240型十萬分之一分析天平；HWS-080恒溫恒濕箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

豬去氧膽酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100087-200610，純度97.3%)；鵝去氧膽酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110806-201105，純度99.2%)；豬膽酸(自制，純度99.3%)；甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；重蒸水；其他試劑為分析純；豬膽購(gòu)自大連礎(chǔ)明肉聯(lián)廠。

東北天南星采自遼寧本溪市，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院王維寧教授鑒定為天南星科植物東北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥塊莖，按照《中華人民共和國(guó)藥典》中天南星項(xiàng)下檢測(cè)方法，測(cè)得水分(8.22%)，總灰分(4.5%)，浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(27.78%)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.32%)，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

自制膽南星樣品：取東北天南星細(xì)粉(過五號(hào)篩)與豬膽汁(經(jīng)絹布濾過)約1∶1比例混合，置30～35 ℃，70%～80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵15～20 d取出，至蒸制容器中蒸1 h至透，趁熱切成1.5～2 cm的小塊，曬至黑褐色，即得。

其余為10批市售商品膽南星樣品見表1。

表1 膽南星樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品制備

取豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.16、0.19、0.32 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取膽南星粉末(過五號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇40 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)50 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰乙酸溶液(60∶40)；流速：1.0 mL·min-1；漂移管溫度：105 ℃；氣體流速：3.0 L·min-1；柱溫為30 ℃；對(duì)照品進(jìn)樣體積為5、20 μL；樣品進(jìn)樣量為5 μL，按上述條件進(jìn)行測(cè)定。色譜圖見圖1。

注：A.膽酸混合對(duì)照品；B.自制膽南星樣品；1.豬膽酸；2.豬去氧膽酸；3.鵝去氧膽酸。圖1 膽酸混合對(duì)照品自制膽南星樣品色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 用移液器分別精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.3、1、2、6、8 mL，置于10 mL量瓶中，色譜甲醇稀釋至刻度，搖勻，得6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液。在2.3色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，以各成分的進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程：豬膽酸為Y=1.550 4X+6.059 0，r=0.999，結(jié)果表明，豬膽酸對(duì)照品進(jìn)樣量在0.032～1.28 μg線性關(guān)系良好。豬去氧膽酸為Y=1.449 3X+5.356，r=0.999，結(jié)果表明，豬去氧膽酸對(duì)照品進(jìn)樣量在0.038～1.52 μg線性關(guān)系良好。鵝去氧膽酸為Y=1.614 6X+5.660 3，r=0.999，結(jié)果表明，鵝去氧膽酸對(duì)照品進(jìn)樣量在0.064～2.56 μg線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD值分別為0.86%、1.4%、0.9%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品5 μL，在0～24 h內(nèi)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD值分別為2.15%、1.90%、2.10%，結(jié)果表明，樣品溶液在所考察時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(自制膽南星)，精密稱取6份，按同樣方法操作，測(cè)得豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.212 0、8.413 3、9.104 2 mg·g-1，RSD值分別為2.60%、2.20%、2.80%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批供試品(自制膽南星)，精密稱取6份，每份約0.25 g，精密稱定，至25 mL容量瓶，分別精密加入豬膽酸對(duì)照品溶液(0.660 6 mg·mL-1，純度99.3%)1.0 mL、豬去氧膽酸(1.105 4 mg·mL-1，純度97.3%)1.8 mL、鵝去氧膽酸(0.488 9 mg·mL-1，純度99.2%)5 mL及甲醇溶液12 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 KHz)50 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定加標(biāo)樣品中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量，結(jié)果見表2～4。

2.4.6 耐用性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液5 μL，按同法操作，分別考察了不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同流動(dòng)相比例(乙腈占比50%、55%、60%)以及不同品牌色譜柱(waters和Ecosil)，結(jié)果豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸色譜峰與其他組分可得到基線分離，表明該方法耐用性良好，見色譜圖2～4。

表2 豬膽酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 豬去氧膽酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 鵝去氧膽酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

注：A.25 ℃；B.30 ℃；C.35 ℃。圖2 膽南星不同檢測(cè)柱溫色譜圖

注：A.乙腈占比50%；B.乙腈占比55%；C.乙腈占比60%。圖3 膽南星不同流動(dòng)相比例檢測(cè)色譜圖

A.Waters C18色譜柱；B.Ecosil C18色譜柱。圖4 膽南星不同色譜柱檢測(cè)色譜圖

2.4.7 檢測(cè)限 應(yīng)用《中華人民共和國(guó)藥典》第四部檢測(cè)限中方法1直觀法可知，豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的檢測(cè)限分別為0.037 6、0.044、0.040 μg，所建立含量測(cè)定方法符合檢測(cè)限要求。

2.4.7 樣品含量測(cè)定 取膽南星樣品，精密吸取對(duì)照品溶液，按同樣項(xiàng)下方法操作，測(cè)得豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量。

表5 膽南星樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

注：“—”表示未檢測(cè)到。

3 討論

3.1 膽酸類含量測(cè)定方法的建立

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)，不同流動(dòng)相比例(乙腈占比50%、55%和60%)，不同柱溫(25、30、35 ℃)以及不同品牌色譜柱(waters和Ecosil)對(duì)于膽南星不同樣品膽酸類成分的影響。結(jié)果表明，提取50 min時(shí)豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸樣品提取含量基本穩(wěn)定且含量較高。乙腈占比50%、55%和60%均能使豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸色譜峰與其他組分可得到基線分離，為節(jié)省時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈占比60%進(jìn)行。柱溫考察時(shí)，綜合待測(cè)物峰面積及對(duì)色譜柱的影響，最終選擇柱溫為30 ℃。本法操作簡(jiǎn)單，所選指標(biāo)與膽南星質(zhì)量密切相關(guān)，可用于膽南星發(fā)酵工藝及質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

3.2 膽南星含量檢測(cè)結(jié)果分析

在調(diào)研中了解到，部分廠家存在發(fā)酵時(shí)間短(24 h)、膽汁加入量差異較大等問題。調(diào)研結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，即不同廠家的膽南星樣品中幾種膽酸類成分含量相差較大，部分樣品未檢測(cè)到游離型膽酸類成分(結(jié)合型膽酸未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化不完全，以致游離型膽酸含量過低)。由此可見，本研究建立的游離型膽酸含量測(cè)定的方法能夠反映發(fā)酵周期、膽汁加入量，可以評(píng)價(jià)膽南星的質(zhì)量。

3.3 膽南星炮制原理研究

膽南星發(fā)酵工藝不規(guī)范、缺少科學(xué)有效的控制指標(biāo)等問題，均源于膽南星的發(fā)酵機(jī)理不清楚。為此，課題組前期做了天南星、膽南星的多成分對(duì)比，包括膽酸類成分、總黃酮、總糖、夏佛托苷、腺苷等核苷類成分[8]，其中膽南星發(fā)酵前后膽酸類成分有明顯的變化規(guī)律，即發(fā)酵后結(jié)合型膽酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型膽酸，且游離型膽酸的含量與發(fā)酵時(shí)間、膽汁加入量密切相關(guān)，可用于膽南星的質(zhì)量控制。

本文以幾種增量的游離型膽酸成分為檢測(cè)指標(biāo)，建立高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)的含量測(cè)定方法，可為膽南星發(fā)酵工藝的規(guī)范化、膽南星質(zhì)量的控制等提供依據(jù)。在今后的研究中，將對(duì)天南星中成分(如總黃酮、糖類)在發(fā)酵前后的變化予以關(guān)注，以期更好地闡釋膽南星的發(fā)酵原理。