雷公藤柱層析中段和末段組分的急性毒性實驗△

張輝，王宜祥，裘穎兒，陳宗良，方遠書，何忠平

金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f為衛(wèi)矛科植物，藥用干燥去皮的根，別名菜蟲藥、黃藤、斷腸草和紅藥。性味苦、辛，溫。有毒[1]。主要分布在長江中下游地區(qū)，但目前野生資源面臨枯竭。雷公藤化學成分非常復(fù)雜，目前已從該植物中分離出二萜類、三萜類、生物堿類和苷類等200多種化合物。治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、慢性關(guān)節(jié)痛等效果明顯，但臨床不良反應(yīng)多發(fā)，肝毒性、腎毒性、生殖毒性、血液毒性等明顯給臨床合理用藥帶來一定的困難，限制了其廣泛應(yīng)用。造成不良反應(yīng)多發(fā)的原因是多方面的，包括自身含有毒性成分、用藥安全范圍窄、缺乏藥理毒理研究資料、提純工藝復(fù)雜、所考察的指標成分不同，作為雷公藤上市制劑的原料提取物是由雷公藤柱層析中段和末段組分按一定比例混合而成，其有效成分、有效部位含量存在很大差異，繼而導(dǎo)致不同上市制劑的臨床療效和不良反應(yīng)差別很大[2]。今后需要在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，加強對雷公藤柱層析各組分的基礎(chǔ)研究，明確藥效、毒性成分及作用機制，獲得高效低毒的雷公藤提取物，為后續(xù)提取純化及制劑研究提供理論基礎(chǔ)；因此，有必要對其提取純化的組分進行系統(tǒng)的有效成分(毒性成分)與毒性關(guān)系的研究。

1 材料

1.1 藥物

雷公藤柱層析中段和末段組分[3](雷公藤醇提物經(jīng)硅膠柱層析純化，用乙醇-三氯甲烷梯度洗脫，收集中段和末段洗脫液，回收溶劑，無水乙醇精制)，由浙江普洛康裕天然藥物有限公司提供。

1.2 動物

清潔級ICR小鼠，(20.0±2.0)g，雌雄各半，由金華市實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2016-0001。普通級SD大鼠，(200±20)g，雌雄各半，由浙江省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

1.3 對照品

雷公藤吉堿(wilforgine)購自上海安譜實驗科技股份有限公司(批號：37239-47-7)，雷公藤次堿(wilforine)購自上海源葉生物科技有限公司(批號：J23A7T19714)。雷公藤甲素(triptolide，批號：111567-201404)、雷公藤內(nèi)酯甲(wilforlide A，批號：111597-200505)、雷公藤內(nèi)酯酮(triptonide，批號：111972-201501)和雷公藤紅素(celastrol，批號：111946-201501)，均購自中國食品藥品檢定研究院。以上對照品純度均大于98%，用于含量測定。

雷公藤多苷工作對照品(批號：1401702)由浙江普洛康裕天然藥物有限公司提供，經(jīng)浙江省食品藥品檢驗研究院標化分裝，僅用于毒理實驗。

1.4 試劑盒

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒(批號：20171115)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測試盒(批號：20171107)，規(guī)格100 T/50樣，均購自南京建成生物工程研究所。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)(批號：080817170911)、Proteinase K(批號：080717171031)，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.5 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，XS205DU型十萬分之一分析天平、MS204S型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)，CX31型OLYMPUS生物顯微鏡，日本島津UV-2600紫外可見分光光度計。

2 方法

2.1 雷公藤柱層析中段和末段組分的含量測定(HPLC法)

參照何昱等[4]建立的測定雷公藤多苷中主要有效成分含量的HPLC方法，色譜柱：Hubble-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為0.1%磷酸-0.2%三乙胺水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫(0～15 min，10%→35% B；15～22 min，35%→35% B；22～30 min，35%→55% B；30～35 min，55% B；35～40 min：55%→60% B；40～70 min：60%→85% B；70～75 min：85%→95% B；75～80 min，95%→10% B)；流速：0.75 mL·min-1；檢測波長：0～65 min時為225 nm，65 min時切換為210 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。測定的有效成分：雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤次堿、雷公藤吉堿、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤紅素。

2.2 中段和末段組分急性毒性實驗

2.2.1 預(yù)實驗 鑒于中段和末段組分的有效成分含量差別比較大，通過前期基礎(chǔ)實驗發(fā)現(xiàn)中段和末段組分對ICR小鼠的毒性表現(xiàn)強弱有別，故對中段組分、末段組分和雷公藤多苷對照品分別摸索能引起實驗小鼠全死的劑量Dm(LD100)以及全活的劑量Dn(LD0)。在預(yù)實驗基礎(chǔ)上確定實驗組數(shù)和各組小鼠給藥量，相鄰的兩組間劑量的比值r=0.9。

2.2.2 急性毒性實驗(經(jīng)口LD50的測定) 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，正式實驗中段和末段組分分別設(shè)置5個劑量組。取ICR小鼠100只，按體質(zhì)量隨機分成10組，每組10只，雌雄各半。分別稱取雷公藤柱層析中段和末段組分適量，加聚山梨酯-80[0.1 mL·(20 mg)-1]，攪勻，加熱使溶解，逐滴加水稀釋至所需最高濃度，再按等比數(shù)列依次稀釋成其他相應(yīng)濃度。小鼠夜間禁食不禁水12 h，于第2天上午9時灌胃給藥1次，灌胃體積為0.20 mL·(10 g)-1。灌胃后各組雌雄分開，每籠5只，正常飼養(yǎng)。給藥后于4、8、24 h分別觀察1次，以后每天觀察1次，連續(xù)觀察7 d。觀察各小鼠外觀、活動狀況、精神和食欲、對外反應(yīng)、排泄物等情況，記錄體質(zhì)量變輕、呼吸急促、異常肌肉運動、異常神經(jīng)活動、異常分泌物等毒性表現(xiàn)和小鼠出現(xiàn)中毒死亡情況(潛伏期、死亡時間、死亡數(shù)量)，對瀕死及死亡小鼠及時解剖，肉眼觀察主要臟器有無變化。如有肉眼可見病變(臟器紅腫、破裂、顏色異常等)，進行組織病理學檢查。觀察期結(jié)束后其他存活的小鼠處死并解剖，根據(jù)各組小鼠的死亡數(shù)，計算LD50及95%的可信區(qū)間。

另取ICR小鼠50只，按體質(zhì)量隨機分成5組，每組10只，雌雄各半。取雷公藤多苷對照品按上述急性毒性實驗方法，計算動物LD50及95%的可信區(qū)間。標準規(guī)定：對照品和供試品的LD50比值應(yīng)為0.90～1.10(LD50平均可信限率不得超過15%，P=0.95)[2]。

2.3 大鼠急性肝損傷實驗

取SD大鼠40只，按體質(zhì)量隨機分成5組，每組8只，雌雄各半。正常對照組、中段組分高劑量組、中段組分低劑量組、末段組分高劑量組、末段組分低劑量組(高劑量組灌胃量200 mg·kg-1，低劑量組灌胃量100 mg·kg-1)。大鼠夜間禁食不禁水12 h，第2天上午9時灌胃1次，正常對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.4 測定大鼠血清中相關(guān)生化指標

48 h后，大鼠眼眶取血，血液室溫下自然凝固15 min，3000 r·min-1，離心20 min，收集上清液，按照生化試劑盒要求比色法測定大鼠血清中AST、ALT濃度。

2.5 HE染色鏡檢

處死各組大鼠后，每只均取肝左外葉約10 mm×10 mm×5 mm組織塊，10%福爾馬林固定，脫水透明、浸蠟、包埋、切片(厚度為5 μm)、貼片、烤片脫蠟、HE染色、脫水封片，在光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。

2.6 TUNEL法檢測肝組織細胞凋亡

每只大鼠各選一張石蠟切片，二甲苯中脫蠟5 min，換用新鮮的二甲苯再脫蠟5 min，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。每張切片滴加20 μg·mL-1不含Dnase的蛋白酶K工作液100 μL，室溫作用30 min，PBS洗滌3次，滴加PBS配制的3%過氧化氫溶液室溫孵育20 min，隨后用PBS洗滌3次，再按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)說明書進行操作。每張切片顯色后光鏡下隨機觀察5個高倍視野(×400)中凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，兩者的比值即為肝細胞凋亡率。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 雷公藤柱層析中段和末段組分的物質(zhì)基礎(chǔ)

精密稱取雷公藤柱層析中段和末段組分各2份，制備供試品溶液，每個供試品溶液進2針，以混合對照品溶液作為對照，用外標法計算含量，結(jié)果見表1，色譜圖見圖1～3。由色譜圖可知，雷公藤柱層析中段和末段組分中所測成分分離度較好，但峰高和峰面積差異較明顯。

表1 雷公藤柱層析中段和末段組分中6種成分含量測定 %

注：1.雷公藤甲素(triptolide)；2.雷公藤內(nèi)酯酮(triptonide)；3.雷公藤吉堿(wilforgine)；4.雷公藤次堿(wilforine)；5.雷公藤紅素(celastrol)；6.雷公藤內(nèi)酯甲(wilforlide A)；下同。圖1 雷公藤混合對照品HPLC圖

圖2 雷公藤柱層析中段組分HPLC圖

圖3 雷公藤柱層析末段組分HPLC圖

由表1可知，中段和末段組分中，在所測成分的含量上差異表現(xiàn)較大。中段組分里雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的含量明顯高于末段，但雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲的含量明顯低于末段。

3.2 LD50的測定結(jié)果

3.2.1 預(yù)實驗 分別摸索出中段組分、末段組分和雷公藤多苷對照品的LD100和LD0(mg·kg-1)，見表2。

表2 雷公藤柱層析中段和末段組分的LD100和LD0值 mg·kg-1

3.2.2 經(jīng)口LD50值 灌胃濃度高的小鼠毒性反應(yīng)出現(xiàn)時間較早(8 h)，給藥后24 h有部分小鼠開始死亡，并伴隨小鼠體質(zhì)量減輕，步態(tài)不穩(wěn)，身體扭曲，翻正反射消失，精神萎靡，無食欲，出現(xiàn)中毒情況，48 h中度死亡小鼠最多，毒性反應(yīng)消失時間較慢，有的在觀察結(jié)束依然體型消瘦，精神不振，有的在給藥后第5天開始恢復(fù)正常。灌胃濃度低的小鼠毒性反應(yīng)出現(xiàn)時間在給藥24 h后，中毒反應(yīng)較弱，毒性反應(yīng)消失時間在給藥后第3天，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)正常增長。解剖實驗中死亡的小鼠，肉眼觀察可見雷公藤中段和末段組分的高濃度組小鼠肝臟顏色變深變暗，表面有顆粒狀，小腸充血明顯。低濃度組主要臟器肉眼觀察未見明顯病理改變。各組小鼠的急性毒性結(jié)果見表3～5，各段組分和對照品的LD50值見表6。

表3 雷公藤柱層析中段組分對小鼠急性毒性結(jié)果

表4 雷公藤柱層析末段組分對小鼠急性毒性結(jié)果

表5 雷公藤多苷對照品對小鼠急性毒性結(jié)果

表6 雷公藤柱層析中段和末段組分LD50值 mg·kg-1

表6表明，中段組分毒性明顯強于末段組分，雷公藤多苷對照品同中段組分和末段組分LD50比值均不在0.90～1.10，中段組分和末段組分要按合理的配比才能用于制劑。

3.3 雷公藤柱層析中段和末段組分對大鼠肝臟的影響

3.3.1 血清轉(zhuǎn)氨酶 由表7血清轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果可知，中段組分高劑量組、末段組分高劑量組、中段組分低劑量組大鼠血清中AST和ALT活性均明顯高于正常對照組(P<0.01)，末段組分低劑量組和正常對照組的差異無統(tǒng)計學意義。相同劑量時，中段組分和末段組分大鼠血清中AST和ALT活性均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。同段組分時，該段的高、低劑量組大鼠血清中AST和ALT活性差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明灌胃雷公藤柱層析中段和末段組分引起肝細胞受損導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，中段組分高劑量組會引起嚴重急性肝損傷。

表7 雷公藤柱層析各段組分對大鼠急性肝損傷的影響 U·L-1

注：與正常對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

3.3.2 肝組織形態(tài)學 雷公藤柱層析中段和末段組分對大鼠肝組織HE病理形態(tài)的改變?nèi)鐖D4所示，光鏡下正常對照組大鼠中央靜脈完好，肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均完整，肝索排列規(guī)則，匯管區(qū)正常，肝血竇結(jié)構(gòu)清晰。中段組分高劑量組肝細胞出現(xiàn)細胞水腫，并且細胞水腫的程度高于中段組分低劑量組；末段組分高劑量組出現(xiàn)輕度的細胞水腫(類似中段組分低劑量組的程度)和脂肪變性，末段組分低劑量組出現(xiàn)輕度的脂肪變性。表明灌胃雷公藤柱層析中段和末段組分后引發(fā)了不同程度的急性肝損傷。

3.3.3 肝細胞凋亡的影響 如圖5所示，正常對照組無明顯凋亡現(xiàn)象，給藥組可見散在分布呈棕黃色或棕褐色的凋亡細胞，核固縮。

圖4 雷公藤柱層析中段和末段組分對大鼠肝組織HE病理形態(tài)的改變(×400)

圖5 各段組分對大鼠肝細胞凋亡的影響(×400)

由表8可知，中段組分高劑量組、末段組分高劑量組、中段組分低劑量組的細胞凋亡率與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，末段組分低劑量組和正常對照組無差異。相同劑量時，中段組分和末段組分大鼠肝細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同段組分時，該段的高、低劑量組大鼠肝細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表8 TUNEL法檢測肝細胞凋亡率

注：與正常對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

4 討論

雷公藤是一種有毒中藥，不同廠家經(jīng)過提取和柱層析純化后所得組分的化學成分基本相同，由雷公藤二萜類、生物堿及三萜類等成分組成，但是質(zhì)量差異較大。另外現(xiàn)有的雷公藤提取工藝研究中，只規(guī)定了雷公藤甲素的上限和雷公藤內(nèi)酯甲的下限，由于單體化合物含量較低，對整個提取物的影響力有限，不能充分反映雷公藤提取物的內(nèi)在質(zhì)量和整體情況。因此我們便對雷公藤柱層析中段和末段組分的多個有效成分進行毒性強弱和毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的比較。

雷公藤粗提物經(jīng)柱層析除雜洗脫后收集中段和末段組分，本實驗為了更好地反映中段和末段組分中有效成分和毒性成分的組成情況，運用HPLC同時測定有代表性的成分，它們從化學結(jié)構(gòu)上歸屬于二萜類、生物堿類、三萜類。由中段和末段組分中所測成分的含量表明二萜類和生物堿類柱層析時富集在中段，三萜類在柱層析最后洗脫。

雷公藤柱層析中段和末段組分中很多成分既是有效成分，又是毒性成分。已知雷公藤的毒性成分主要是二萜類(雷公藤甲素等)、生物堿、三萜類及苷類化合物等。環(huán)氧二萜內(nèi)酯是雷公藤研究最廣泛的化學成分，其代表成分是雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide)，又稱雷公藤甲素，具有顯著的抗炎及免疫抑制活性，但易產(chǎn)生肝、腎、生殖系統(tǒng)等毒性[5]。生物堿類主要損害肝、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并可破壞紅細胞，引起進行性貧血，甚至誘發(fā)腎小管缺氧性損害，吸收后損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可導(dǎo)致嚴重營養(yǎng)不良性改變。在雷公藤制劑中，對生物堿的量進行質(zhì)量控制，有助于提高制劑的有效性和安全性[6]。

我們采用經(jīng)典的小鼠急性毒性實驗對雷公藤柱層析中段和末段組分的毒性作用進行比較，結(jié)合所測成分的含量，進行毒性評價。各段組分的小鼠經(jīng)口LD50值表明中段的毒性明顯強于末段，同中段組分里雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的含量高相關(guān)，這些二萜和生物堿類成分決定了中段的毒性強、安全范圍小。對死亡小鼠解剖和病理切片推測雷公藤柱層析中段和末段組分致小鼠急性毒性死亡原因跟灌胃劑量、毒性成分密切相關(guān)，病理方面主要以急性肝損傷為主。

雷公藤肝毒性的基礎(chǔ)研究較多，對雷公藤肝毒性機制的了解尚不透徹[7]。馬致潔等[8]通過體外人肝L02細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)雷公藤對肝細胞的損傷呈劑量依賴性，為開展中藥配伍減毒增效提供新方法。這些基礎(chǔ)研究為雷公藤臨床合理用藥提供了參考，從臨床表現(xiàn)看雷公藤導(dǎo)致的肝毒性多為急性，大鼠的急性肝損傷實驗結(jié)果顯示中段組分高劑量組、末段組分高劑量組、中段組分低劑量組大鼠血清中AST和ALT活性、細胞凋亡率與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，HE切片顯示給藥組有不同程度的水腫和脂肪變性，表明雷公藤柱層析中段和末段組分能不同程度地造成急性肝損傷，引起肝細胞凋亡，說明毒性作用是多種毒性成分共同作用的結(jié)果，成分和含量的差異與毒性的強弱有關(guān)聯(lián)，毒性成分一定濃度范圍內(nèi)(中段組分高劑量至中段組分低劑量，這段濃度范圍內(nèi)觀測指標和毒性有明顯差異)存在較好的含量-毒性關(guān)系，毒性機制需要進一步去研究。