脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜研究

俞潔東 曾海松 吳革林等

[摘要] 目的 建立脈絡(luò)通顆粒高效液相（HPLC）指紋圖譜，并采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）系統(tǒng)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，為脈絡(luò)通顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。 方法 采用Phenomenex Luna C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.3%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。測(cè)定10批脈絡(luò)通顆粒，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）建立脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜，采用正、負(fù)離子模式對(duì)共有峰進(jìn)行成分分析，并通過(guò)現(xiàn)有對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)。 結(jié)果 建立了脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了21個(gè)共有峰，分別歸屬到了8味藥材，液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)指認(rèn)了其中19個(gè)共有峰，其中7個(gè)采用對(duì)照品對(duì)比確認(rèn)。 結(jié)論 該方法重現(xiàn)性好、特征性強(qiáng)，能為脈絡(luò)通顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)，并可為其他中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

[關(guān)鍵字] 脈絡(luò)通顆粒;指紋圖譜;共有峰;三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)

[中圖分類號(hào)] R286.0? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（a）-0039-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Mailuotong Granules， and qualitatively analyze its chemical composition by triple quadrupole liquid chromatography-mass （LC-MS） system， and provide evidence for the quality evaluation of Mailuotong Granules. Methods Phenomenex Luna C18 （2） column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used. Acetonitrile-0.3% formic acid solution was used as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 25℃， and the detection wavelength was 270 nm. Ten batches of Mailuotong Granules were determined. The fingerprint of Mailuotong Granules was established with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2004A edition）. The common peaks were analyzed by positive and negative ion modes， and confirmed by the existing reference substances. Results The HPLC fingerprints of Mailuotong Granules were established. A total of 21 common peaks were identified and assigned to 8 herbs. The LC/MS system identified 19 common peaks， 7 of which were confirmed by comparison. Conclusion The method has good reproducibility and strong characteristics， which can provide a basis for the quality control of Mailuotong Granules and provide reference for the material basic research of other traditional Chinese medicine compounds.

[Key words] Mailuotong Granules; Fingerprint; Common peak; Triple quadrupole liquid chromatography-mass system

脈絡(luò)通顆粒是由黨參、當(dāng)歸、地龍、丹參、紅花、木賊、葛根、槐米、山楂、川芎等10味藥材制成，具有益氣活血、化瘀止痛等功效，用于胸痹引起的心胸疼痛、胸悶氣短、頭痛眩暈及冠心病心絞痛諸癥，以及中風(fēng)引起的肢體麻木、半身不遂等癥。目前，藥理和主成分含量測(cè)定及大孔樹脂有機(jī)殘留物[1-4]是其研究熱點(diǎn)，但缺少整體評(píng)價(jià)的質(zhì)控方法，無(wú)法滿足中藥現(xiàn)代化的要求。

中藥指紋圖譜具有整體性、模糊性和特征性，是國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段[5-10]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有的高效液相色譜的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，是控制中藥質(zhì)量的有力工具。本研究建立了脈絡(luò)通顆粒的高效液相指紋圖譜，共標(biāo)定了21個(gè)共有峰，并將其歸屬到各藥味;采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和對(duì)照品指認(rèn)法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，為脈絡(luò)通顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器）、Agilent 6460 Triple Quad LC/MS三重串聯(lián)四極桿（配有ESI電源、Agilent Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件），美國(guó)Agilent公司;XPE-205十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）、KQ-250型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

葛根素（生產(chǎn)批號(hào)：110752-201514）、蘆?。ㄉa(chǎn)批號(hào)：100080-200707）、阿魏酸（生產(chǎn)批號(hào)：110773-201614）、黨參炔苷（生產(chǎn)批號(hào)：111732-200905）、丹酚酸B（生產(chǎn)批號(hào)：11562-201111）、槲皮素（生產(chǎn)批號(hào)：10081-9905）、山柰素（生產(chǎn)批號(hào)：110861-201310）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;脈絡(luò)通顆粒（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。

乙腈為色譜純（德國(guó)Merck KGaA公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件? 色譜柱為Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%乙腈;3～50 min，5%～42%乙腈;50～50.1 min，42%～95%乙腈;50.1～60 min，95%乙腈;流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件? 采用ESI電離源，正離子模式下：毛細(xì)管電壓3500 V，霧化器壓力35 psi，干燥氣溫度300℃，干燥氣體積流量10 L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11 L/min，碎片電壓135 V，噴嘴電壓1000 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 500～1200;負(fù)離子模式下條件與正離子模式相同。

2.2 溶液制備方法

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備? 取葛根素、蘆丁、阿魏酸、黨參炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含葛根素112 μg、蘆丁204 μg、阿魏酸44 μg、黨參炔苷32 μg、丹酚酸B 92 μg、槲皮素40 μg、山柰素28 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備? 取脈絡(luò)通顆粒2.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）處理20 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號(hào)：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以最高峰蘆丁為參照峰，計(jì)算標(biāo)定峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并對(duì)圖譜進(jìn)行相似度比較。結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號(hào)：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液。以最高峰蘆丁為參照峰，計(jì)算標(biāo)定峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，并對(duì)圖譜進(jìn)行相似度比較。結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性? 取脈絡(luò)通顆粒（生產(chǎn)批號(hào)：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制樣后0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以最高峰蘆丁為參照峰，計(jì)算標(biāo)定峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并對(duì)圖譜進(jìn)行相似度比較。結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均≤3.0%，圖譜間的相似度均為1.000，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 對(duì)照指紋圖譜的建立? 將收集到的14批樣品按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。隨機(jī)取10批脈絡(luò)通顆粒的色譜信息，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)10批樣品進(jìn)行分析，以S1為參照采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定21個(gè)共有峰。見圖1。

2.4.2 指紋圖譜分析? 將測(cè)定獲得的14批樣品的色譜信息采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）與生成的對(duì)照指紋圖譜（R）進(jìn)行相似度比較評(píng)價(jià)。14批脈絡(luò)通顆粒相似度均在0.9以上，說(shuō)明產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性良好。見表1。

2.5 色譜峰指認(rèn)

2.5.1 對(duì)照品法指認(rèn)? 利用對(duì)照品對(duì)各色譜峰的成分進(jìn)行指認(rèn)。通過(guò)比較各峰的保留時(shí)間和紫外吸收光譜確定了7個(gè)化合物，分別為葛根素、蘆丁、阿魏酸、黨參炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素。見圖2。

2.5.2 高效液相色譜-質(zhì)譜法指認(rèn)

比較ESI負(fù)離子和ESI正離子模式條件下供試品溶液的信息情況，發(fā)現(xiàn)黨參酸在ESI負(fù)離子模式條件下無(wú)響應(yīng)，山柰素在ESI正離子模式條件下響應(yīng)較弱。見圖2～3。

通過(guò)對(duì)各成分質(zhì)譜裂解信息的分析，對(duì)脈絡(luò)通顆粒中的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)。在對(duì)照品法指認(rèn)的7個(gè)成分的基礎(chǔ)上又推測(cè)出12個(gè)成分。結(jié)合文獻(xiàn)[10-21]對(duì)HPLC-MS法和對(duì)照品指認(rèn)法確認(rèn)的共19個(gè)化合物進(jìn)行歸屬，分別歸屬到8味藥材，即黨參、當(dāng)歸、丹參、木賊、葛根、槐米、山楂、川芎。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

本研究分別對(duì)提取溶劑（10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇）、提取溶劑體積（25、50、75 mL）、提取方式（超聲、回流）、提取時(shí)間（5、10、20、30、40 min）進(jìn)行了考察，結(jié)果最佳提取方法為加70%乙醇50 mL超聲提取20 min。

3.2 色譜條件考察

本研究分別對(duì)洗脫系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-酸水、甲醇-水、甲醇-酸水）、酸及濃度（甲酸、乙酸、磷酸）、柱溫（20℃、25℃、30℃）、檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜柱進(jìn)行了考察，最終確定色譜條件為色譜柱Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脫，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

本研究建立了脈絡(luò)通顆粒的HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定21個(gè)化合物，并用高效液相色譜-質(zhì)譜法鑒定了其中19個(gè)化合物，其中7個(gè)化合物采用對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)。本品共由10味藥材組成，已鑒定的化合物分別歸屬于8味藥材，提示本研究建立的指紋圖譜符合指紋圖譜對(duì)整體性的要求。

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（收稿日期：2018-05-22? 本文編輯：王? ?蕾）