克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物中ACE抑制肽的分離純化與鑒定

李銳，鄒茜，孫玉林，王林，馮明會(huì)，李想*

1(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江，524048)2(四川旅游學(xué)院，四川 成都，610100) 3(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南 昆明，650205)

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，2017年全世界高血壓患病人數(shù)高達(dá)9.72億[1]。人體中機(jī)體血壓和體液平衡主要由腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)來進(jìn)行調(diào)節(jié)，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)在系統(tǒng)中起重要作用，它能夠調(diào)節(jié)人體鹽-水平衡和動(dòng)脈血壓[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽(ACE inhibitory peptides, ACE抑制肽) 是一類具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的多肽類物質(zhì)[3]。ACE抑制劑通過抑制人體內(nèi)ACE酶的活性，降低對(duì)舒緩激肽的破壞作用，從而減少血管緊張素Ⅱ的合成，達(dá)到控制血壓上升的目的[4-5]。目前，許多人工合成的ACE抑制劑雖然具有良好的降血壓療效(如福辛普利、西拉普利等)，但同時(shí)會(huì)使人體產(chǎn)生頭痛、咳嗽、眩暈、疲勞等負(fù)面作用[6-7]。食源性生物活性肽是以食源性蛋白質(zhì)為原料制備的，具有低過敏性、安全、無毒等優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越受到人們的青睞。目前人們已用玉米[8]、魔芋[9]、帶魚脊骨[10]、泰和烏骨雞肉[11]、沙丁魚[12]及紅松仁[13]等制備得到了ACE抑制肽。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)，俗稱小龍蝦。2016年我國小龍蝦總產(chǎn)量達(dá)到89.91萬t，是全世界世界最大的小龍蝦生產(chǎn)國[14]?？耸显r在加工過程中有接近整蝦質(zhì)量50%～ 80%的蝦頭、蝦殼被廢棄或者加工成飼料，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[15]。據(jù)研究，克氏原螯蝦蝦頭中粗蛋白含量為13.13%，同時(shí)含有豐富的脂類、蝦青素和生物活性物質(zhì)，可以作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源[16]。利用蛋白酶水解克氏原螯蝦蝦頭，其酶解產(chǎn)物中含有大量的短肽、氨基酸等物質(zhì)。這些小分子肽具有各種生物活性，經(jīng)過分離純化后得到具有特殊生物活性的功能肽，可作為功能食品應(yīng)用于保健與預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景[17-20]。

目前，國內(nèi)外利用克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物制備ACE抑制肽的研究鮮見報(bào)道。本研究以克氏原螯蝦蝦頭為原料，通過模擬胃腸道消化制備酶解液。以ACE抑制率為指標(biāo)，通過超濾、凝膠色譜、離子色譜、反向高效液相色譜對(duì)模擬胃腸道消化產(chǎn)物進(jìn)行分離篩選，以期獲得具有較高ACE抑制活性的高純度單一肽，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

克氏原螯蝦蝦頭，鮮活的克氏原螯蝦(Procamb-arusclarkia)購于四川省成都市青羊區(qū)麥德龍超市，洗凈瀝干水分后取蝦頭，分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｎ傅鞍酌?酶活力1 200 U/g)和胰蛋白酶(酶活力50 000 U/g)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰凝乳蛋白酶(1 500 U/g)， 購于美國Sigma公司。

ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨(N-Hippuryl-His-Leu，HHL)，購于美國Sigma公司；馬尿酸，購自美國Sigma公司；葡聚糖凝膠(Sephadex G-25、Sephadex G-15)、陰離子交換樹脂Capto Q，購于美國GE公司；福林-酚試劑，購自北京鼎國生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

真空冷凍干燥機(jī)FDU-1100，日本東京理化器械株式會(huì)社；LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；高效液相色譜儀LC1200，美國Agilent公司；Mini Pellicon超濾系統(tǒng)，德國Merck Millipore有限公司；WTM-CM-01陶瓷膜分離設(shè)備，杭州沃騰膜有限公司；高速冷凍離心機(jī)HF-2100R，美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物的制備

技術(shù)路線：

克氏原螯蝦蝦頭→前處理→絞碎均質(zhì)→滅酶→模擬胃消化→模擬腸道消化→200目濾布過濾→0.2 μm陶瓷膜過濾→-10 ℃保存?zhèn)溆?/p>

模擬胃腸道消化參考JOHNS等[23]的方法，稍作改動(dòng)。原料預(yù)處理：取冷凍的克氏原螯蝦蝦頭置于4 ℃解凍，絞碎后添加適量蒸餾水(質(zhì)量比1∶2)，用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min(轉(zhuǎn)速5 000 r/min)，于80 ℃的水浴中充分加熱20 min，使蝦頭內(nèi)源酶失活。體外模擬胃消化：用1 mol/L的HCl溶液將勻漿液pH值調(diào)到2.0，按m(酶)∶m(底物)=1∶50添加胃蛋白酶，混勻后于37 ℃下攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，置于90～100 ℃的水浴中加熱10 min，使胃蛋白酶失活。體外模擬腸道消化：用1 mol/L的NaOH溶液將酶解液pH值調(diào)到7.5，按復(fù)合酶添加量(m(胰蛋白酶)∶m(胰凝乳蛋白酶)=6∶1)，底物質(zhì)量比為1∶25的比例添加復(fù)合酶，混勻后于37 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后，置于80 ℃的水浴中充分加熱20 min，使胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶失活。之后將酶解液用200目的濾布通過三足離心機(jī)過濾，可除去大部分固體顆粒，再用陶瓷膜(孔徑0.2 μm)過濾，得到的濾液即為克氏原螯蝦蝦頭模擬腸胃道消化產(chǎn)物(SGDP)，放置于-10 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別在模擬消化過程 10、30、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390 min取樣；于80 ℃加熱20 min終止反應(yīng)；于4 500 r/min離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.0；于4 500 r/min離心30 min去除大分子蛋白，得到樣品液。

1.2.2 ACE抑制活性的測(cè)定

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定參考朱國萍等[24]的方法。

ACE抑制活性的測(cè)定參考王晶晶等[12]的方法，稍作改動(dòng)。未加樣品組：取5 mL離心管依次加入50 μL超純水和50 μL HHL溶液，37 ℃溫浴20 min，再加入50 μL ACE于37 ℃溫浴20 min，加入150 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。樣品組：取5mL離心管依次加入50 μL 樣品溶液和50 μL HHL溶液，37 ℃溫浴20 min， 再加入50 μL ACE于37 ℃溫浴20 min，加入150 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。高效液相色譜測(cè)定條件：Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；檢測(cè)波長為228 nm；流速為1 mL/min；流動(dòng)相A：超純水(含0.05%三氟乙酸,V/V)；流動(dòng)相B：乙腈(含有0.05%三氟乙酸,V/V)；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫: 25 ℃； 洗脫條件：V(B)∶V(A)=25%∶75%。ACE抑制率的公式如式(1)：

(1)

式中:A，未加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；B，加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；其中ACE抑制率為 50%時(shí)ACE的濃度即為半數(shù)抑制濃度(mg/mL)，記為IC50。

1.2.3 水解度測(cè)定

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定參考NILSANG等[25]的方法。取1 mL的樣品溶液和2 mL的去離子水加入250 mL的錐形瓶，再加入10 mL去離子水，用0.05 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，再加入4 mL體積分?jǐn)?shù)18%的甲醛溶液，混勻后用0.05mol/L的NaOH溶液將pH滴定至9.5，記錄滴定消耗的NaOH溶液體積，計(jì)算樣品中氨基態(tài)氮的含量，記為A；原料總氮和非蛋白氮含量采用微量凱氏定氮法測(cè)定。

水解度(degree of hydrolysis, DH)按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：A，樣品中總氮量；B，樣品中的氨基氮量；C，樣品中游離的氨基氮量；D，樣品中的非蛋白氮量。

1.2.4 分子質(zhì)量測(cè)定

分子質(zhì)量測(cè)定參考劉建華等[11]的方法。

1.2.5 超濾分離

取克氏原螯蝦模擬腸胃道消化產(chǎn)物，置于-4 ℃解凍，在溫度為25 ℃、壓力為40 Psi、流速為0．5 m/s的條件下分別用8 000 u、5 000 u和3 000 u的超濾膜超濾，得到4個(gè)不同組分，分別為C1 (MW> 8 000 u)、C2(5 000 u

1.2.6 Sephadex G-25凝膠層析分離

將超濾組分用Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析柱(l.6 cm×40 cm)進(jìn)行層析分離。分離條件為：以超純水(過0.45 μm濾膜)作為洗脫液，上樣濃度為5 mg/mL， 檢測(cè)波長為220 nm，流速為 1 mL/min，上樣體積為2 mL。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測(cè)定ACE抑制活性。

1.2.7 Capto Q離子交換層析分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，用Capto Q離子交換柱(2.6 cm×12 cm)進(jìn)行分離。分離條件為：緩沖液為0.05 mol/mL Tris-HCl溶液(pH 9.5)，洗脫液為0.5 mol/mL NaCl溶液，上樣體積為10 mL，流速為0.5 mL/min，上樣濃度為2 mg/mL，檢測(cè)波長為220 nm。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測(cè)定ACE抑制活性。

1.2.8 Sephadex G-15凝膠層析分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱(1.6 cm×70 cm) 進(jìn)行分離。分離條件為：以超純水(過0.45 μm濾膜)作為洗脫液，上樣濃度為5 mg/mL，檢測(cè)波長為220 nm，流速為0.5 mL/min，上樣體積為2 mL。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測(cè)定ACE抑制活性。

1.2.9 RP-HPLC分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，使用YMC-Pack ODS-AQ C18色譜柱(4.0 mm× 250 mm, 5 μm)進(jìn)行RP-HPLC純化。分離條件為：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為超純水(過0.45 μm濾膜)，梯度洗脫程序：0～60 min，乙腈濃度按直線斜率從0%升到60%；上樣濃度為5 mg/mL，檢測(cè)波長為220 nm，流速為1.0 mL/min，上樣體積為2 mL。

1.2.10 氨基酸序列鑒定

RP-HPLC分離后得到1個(gè)ACE抑制活性較高的組分，使用Thermo LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀進(jìn)行ESI MS/MS質(zhì)譜測(cè)定其氨基酸序列。樣品前處理：將樣品冷凍干燥后制成干粉，用超純水復(fù)溶后過0.45 μm濾膜，然后上樣。測(cè)定條件：上樣濃度為300 μg/mL，源加熱溫度為200 ℃，鞘氣流速為8 L/min，輔助氣流速為2.5 L/min， 噴霧電壓為+3.0 kV，毛細(xì)管溫度為300 ℃。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)，使用Origin 8.0和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同階段消化產(chǎn)物的水解度和ACE抑制活性

圖l為克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物不同階段的水解度和ACE抑制活性。在體外模擬胃消化的階段中，10～120 min，消化產(chǎn)物的水解度從4.72% 快速上升到13.16%，而其ACE抑制率從10 min 的49.63%緩慢上升到69.73%。由此可知，在體外模擬胃消化的過程中，蝦頭中的蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下，發(fā)生水解，其水解度逐漸增大。

圖1 克氏原螯蝦蝦頭模擬消化過程中酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制活性的變化Fig.1 Change of DH and ACE inhibitory activity of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of Procambarus clarkia head

同時(shí)，由于胃蛋白酶在蝦頭蛋白上存在特殊作用位點(diǎn)，產(chǎn)生了一部分具有對(duì)胃蛋白酶有耐受性，且具有較高ACE抑制活性的多肽，使得消化產(chǎn)物總體的ACE抑制活性緩慢上升。消化產(chǎn)物在模擬腸道消化過程中，120～180 min，消化產(chǎn)物的水解度急劇升高，從13.16%上升到30.98%。這個(gè)結(jié)果說明，在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，大量蝦頭蛋白被水解，生成小分子肽類物質(zhì)。210～390 min，消化產(chǎn)物的水解度變化不大，增加趨勢(shì)變緩，原因可能是蝦頭蛋白水解基本完成，并且胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶經(jīng)過長時(shí)間作用，其酶活有所降低[22]。消化產(chǎn)物的ACE抑制活性在進(jìn)入模擬腸道的消化環(huán)境后，開始快速下降，ACE抑制率從120 min的69.73%下降到210 min的54.69%。240～390 min，消化產(chǎn)物的ACE抑制率保持在52.96%～55.43%，整體變化不大。消化產(chǎn)物的小分子肽在模擬胃消化的環(huán)境中，對(duì)胃蛋白酶的耐受性較強(qiáng)，但對(duì)胰酶具有較弱的耐受能力，當(dāng)進(jìn)入模擬腸道消化的環(huán)境時(shí)，部分肽鍵在胰酶的作用下被切斷，導(dǎo)致其ACE抑制活性下降[11,21]。而在240 min后，ACE抑制活性變化不大，說明殘留的活性肽在腸道環(huán)境中對(duì)胰酶具有較強(qiáng)的耐受性，其ACE抑制活性趨于穩(wěn)定。消化產(chǎn)物在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，其ACE抑制率為55.43%，此時(shí)消化產(chǎn)物一般位于小腸部位，這些小分子肽容易被小腸的上皮細(xì)胞吸收到機(jī)體內(nèi)，可以在體內(nèi)發(fā)揮ACE抑制活性?？耸显r蝦頭模擬消化不同階段ACE抑制活性的變化規(guī)律，與劉建華等[11]報(bào)道泰和烏骨雞肉模擬消化產(chǎn)物ACE抑制活性的結(jié)果接近。

2.2 克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物的超濾分離

通過超濾系統(tǒng)用3 000、5 000和8 000 u的濾膜對(duì)克氏原螯蝦蝦頭模擬消化產(chǎn)物進(jìn)行超濾分級(jí)分離，收集透過液和截留液，測(cè)定各組分的半數(shù)抑制濃度濃度IC50值。結(jié)果如圖2所示。

圖2 模擬消化產(chǎn)物超濾組分的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibitory activity of the ultrafiltration fractions of products under the simulated digestion

測(cè)定模擬消化產(chǎn)物(SGDP)和4個(gè)超濾組分的ACE抑制活性，其中組分C4(MW<3 000 u)的ACE抑制活性最高，IC50值為0.97 mg/mL。通過超濾膜分離，模擬消化產(chǎn)物ACE抑制活性的IC50值從1.84 mg/mL(SGDP)下降到0.97 mg/mL(組分C4)，純化倍數(shù)為1.89倍。

采用高效液相空間排阻法，對(duì)ACE抑制活性最高的組分C4分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定(表1)。組分C4中分子質(zhì)量分布顯示，分子質(zhì)量在3 000 u以下占67.74%， 其分子質(zhì)量主要在3 000～2 000 u，占31.28%，數(shù)均分子質(zhì)量和重均分子質(zhì)量分別為2 286.19 u和2 311.80 u。組分C4的數(shù)均分子質(zhì)量和重均分子質(zhì)量分別為2 804.55 u和1 894.30 u。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的活性肽分子質(zhì)量各不相同，而同種來源的活性肽在不同的分子質(zhì)量也會(huì)表現(xiàn)出不同的生物活性。國內(nèi)外的研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ACE抑制活性較高的肽類主要集中在3 000 u以下。朱國萍等[24]報(bào)道，用蝦頭制備自溶產(chǎn)物，其3 000 u超濾組分的ACE抑制活性最高。苗欣宇等[13]采用超濾對(duì)松仁清蛋白酶解液進(jìn)行分離，得到3個(gè)組分(A1<3 000 u、 A2 3 000～10 000 u和A3>10 000 u)，A1組分的ACE抑制率和比活力均高于其他組分。綜上，選擇組分C4進(jìn)行Sephadex G-25凝膠層析分離。

表1 組分C4的分子質(zhì)量分布Table 1 Distribution of peptide molecular weight of fraction C4

2.3 Sephadex G-25凝膠層析分離

利用Sephadex G-25凝膠層析對(duì)組分C4進(jìn)行分離純化，得到5個(gè)組分，分別命名為C4-1、C4-2、C4-3、C4-4和C4-5(圖3)。

圖3 組分C4的Sephadex G-25分離圖譜Fig.3 Chromatogram of fraction C4 separated on Sephadex G-25

將各組分冷凍干燥，取干粉用超純水溶解，測(cè)定各個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度濃度IC50值(圖4)。其中組分C4-2的ACE抑制活性最高，IC50值為0.42 mg/mL，與蝦頭模擬消化產(chǎn)物相比，純化倍數(shù)為4.38倍。因此，選擇組分C4-2進(jìn)行下一步的分離純化。

圖4 Sephadex G-25分離組分的ACE抑制活性Fig.4 ACE inhibitory activity of fractions separated on Sephadex G-25

2.4 Capto Q離子交換層析分離

如圖5所示，利用Capto Q離子交換層析對(duì)組分C4-2進(jìn)行分離純化，得到5個(gè)組分，分別命名為C4-2-1、C4-2-2、C4-2-3、C4-2-4和C4-2-5。將各組分冷凍干燥，取干粉用超純水溶解，測(cè)定各個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度濃度IC50值(圖6)，其中組分C4-2-5的ACE抑制率最高，IC50值為0.29 mg/mL，與蝦頭模擬消化產(chǎn)物相比，純化倍數(shù)為6.34倍。因此，選擇組分C4-2-5進(jìn)行下一步的分離純化。

圖5 組分C4-2的Capto Q離子交換層析分離圖譜Fig.5 Chromatogram of fraction C4-2 separated on Capto Q

圖6 Capto Q離子交換層析分離組分的ACE抑制活性Fig.6 ACE inhibitory activity of fractions separated on Capto Q

2.5 Sephadex G-15凝膠層析分離

利用Sephadex G-15凝膠層析對(duì)組分C4-2-5進(jìn)行分離純化，得到3個(gè)組分，分別命名為C4-2-5-1、C4-2-5-2和C4-2-5-3(圖7)。測(cè)定各個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度濃度IC50值(圖8)，其中組分C4-2-5的ACE抑制率最高，IC50值為0.18 mg/mL，與蝦頭模擬消化產(chǎn)物相比，純化倍數(shù)為10.22倍。經(jīng)過Sephadex G-15凝膠層析分離，組分的ACE抑制活性得到大幅度提升，選擇組分C4-2-5-2進(jìn)行下一步的分離純化。

圖7 組分C4-2-5的Sephadex G-15分離圖譜Fig.7 Chromatogram of fraction C4-2-5 separated on Sephadex G-15

圖8 Sephadex G-15分離組分的ACE抑制活性Fig.8 ACE inhibitory activity of fractions separated on Sephadex G-15

2.6 RP-HPLC分離

組分C4-2-5-2經(jīng)RP-HPLC分離后得到的色譜圖如圖9所示。

圖9 組分C4-2-5-2的RP-HPLC分離圖譜Fig.9 Chromatogram of fraction C4-2-5-2 separated on RP-HPLC

由于雜峰較多，選擇收集2個(gè)主要組分峰，分別命名為C4-2-5-2-1和C4-2-5-2-2，并測(cè)定2個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度濃度IC50值(圖10)，組分C4-2-5-2-1的ACE抑制率最高，IC50值為0.11 mg/mL，組分C4-2-5-2-2的ACE抑制活性稍低，為0.14 mg/mL。對(duì)2個(gè)組分進(jìn)行RP-HPLC驗(yàn)證(圖11)，組分C4-2-5-2-1雜峰較少，成分單一；而組分C4-2-5-2-2的RP-HPLC圖譜還有較多的雜峰，成分復(fù)雜，因此選擇組分C4-2-5-2-1作為單一組分的ACE抑制肽。

圖10 RP-HPLC分離組分的ACE抑制活性Fig.10 ACE inhibitory activity of fractions separated on RP-HPLC

A-組分C4-2-5-2-1;B-C4-2-5-2-2 圖11 組分C4-2-5-2-1和C4-2-5-2-2的RP-HPLC分離圖譜Fig.11 Chromagram of fraction C4-2-5-2-1 and C4-2-5-2-2 separated on RP-HPLC

研究表明，高純度的ACE抑制肽通常采用多種分離方法相結(jié)合的方式來進(jìn)行制備。苗欣宇等[12]采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對(duì)松仁清蛋白酶解液進(jìn)行分離純化，獲得1個(gè)ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys。陳小藝等[26]以鮑魚內(nèi)臟多肽酶解液為研究對(duì)象，通過超濾、DEAE-52纖維素陰離子交換層析和葡聚糖G-25凝膠層析對(duì)其進(jìn)行分離純化，最終得到1個(gè)膠原ACE抑制肽。朱國萍等[24]從蝦頭自溶產(chǎn)物中分離純化得到2條ACE抑制肽(Tyr-Pro和Leu-Pro/Ile-Pro)，依次經(jīng)過超濾、Sephadex G-25 葡聚糖凝膠層析、SP Sephadex C-25離子交換層析及Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析純化，ACE抑制活性提高將近8倍。克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物的半抑制濃度IC50值為1.84 mg/mL，依次經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、Capto Q離子交換層析、Sephadex G-15凝膠層析、RP-HPLC，IC50值降到0.11 mg/mL，ACE抑制肽的IC50值純化了16.72倍(表2)。因此，將組分C4-2-5-2-1作為分離純化的克氏原螯蝦蝦頭模擬消化產(chǎn)物ACE抑制肽終產(chǎn)物，并對(duì)其肽序列進(jìn)行研究。

表2 模擬消化產(chǎn)物中ACE抑制肽的純化情況表Table 2 Purification of ACE inhibitory peptide derived from products under the simulated digestion

2.7 氨基酸序列鑒定

采用電噴霧靜電場(chǎng)離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(LTQ Orbitrap ESI MS/MS)對(duì)組分C4-2-5-2-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，將分析結(jié)果輸入PEAKS 7.0 軟件通過從頭測(cè)序法來分析多肽的氨基酸序列[27]。組分C4-2-5-2-1經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜碎裂獲得較多的離子片斷，從眾多離子片斷中選擇信號(hào)較強(qiáng)、分子質(zhì)量為235.4 u的離子片斷進(jìn)行二級(jí)電離(圖12、圖13)。根據(jù)ACE抑制肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖譜，通過PEAKS軟件的分析推測(cè)出b離子碎片和y離子碎片斷裂的方式(表3)。對(duì)照表3和圖13可知，b1=112.2，y1=185.1和離子片段Pro-Val相吻合，因此組分C4-2-5-2-1的氨基酸序列為脯氨酸-纈氨酸(Pro-Val)，分子質(zhì)量為225 u。

研究發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽一般是由2～12氨基酸殘基組成，大部分為分子質(zhì)量較小的短肽，其中二肽和三肽居多[28]。KLEEKAYAI等[29]從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵蝦膏中分離得到一個(gè)ACE抑制肽，其氨基酸序列為Ser-Val。王晶晶等[12]從遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物中分離出具有較高活性的六肽Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro和三肽Pro-Ala-Leu，它們的IC50值分別為22.9 μmol/L和12.2 μmol/L。YAMADA等[30]從牛乳酪蛋白水解液中得到一個(gè)新型αs2-酪蛋白源新型三肽MKP，其IC50值為0.12 μg/mL。另外，ACE抑制肽的活性也與氨基酸組成由很大的關(guān)系。SUETSUNA等[31]對(duì)15種魚蝦貝不同來源的ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貝類ACE抑制肽氨基酸組成多為Asp、Lys和Glu，而魚類ACE抑制肽氨基酸組成多為Glu、Ile、Asp和Lys。但迄今為止，ACE抑制肽作用機(jī)制與結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不明確。有研究學(xué)者指出，活性肽的C-末端氨基酸殘基為芳香族氨基酸殘基(Tyr、Trp、Phe)或Pro，N-末端為Pro或疏水性氨基酸殘基(Ile、Val、Leu)時(shí)，能與ACE產(chǎn)生強(qiáng)烈的結(jié)合作用，表現(xiàn)出顯著的ACE抑制活性，而C-末端殘基在ACE競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)上占主導(dǎo)地位[32-33]。組分C4-2-5-2-1的氨基酸序列為脯氨酸-纈氨酸(Pro-Val)，其C-末端氨基酸殘基為Pro，該結(jié)構(gòu)與前人的研究結(jié)果相一致。

表3 組分C4-2-5-2-1可能的幾種序列及其b離子與y離子的理論值Table 3 The theory value for b and y ion and the possible sequence of fraction C4-2-5-2-1

圖12 組分C4-2-5-2-1的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.12 The primary mass spectrogram of fraction C4-2-5-2-1

圖13 組分C4-2-5-2-1的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.13 Tandem mass spectrum of fraction C4-2-5-2-1

3 結(jié)論

克氏原螯蝦蝦頭通過模擬腸胃道消化進(jìn)行酶解，消化產(chǎn)物中的ACE抑制肽主要分布在分子質(zhì)量低于3 000 u 的超濾組分中；通過凝膠色譜、離子色譜、反向高效液相色譜相結(jié)合的方法對(duì)分子質(zhì)量小于3 000 u的超濾組分進(jìn)行分離純化與篩選，獲得了1個(gè)新型ACE抑制肽，該活性肽分子質(zhì)量為225 u，肽序列為Pro-Val；IC50值為0.11 mg/mL，與模擬消化產(chǎn)物相比，IC50值純化了16.72倍。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為克氏原螯蝦蝦頭的開發(fā)和高附加值利用提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為食源性降血壓肽的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)僅系統(tǒng)研究了克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物ACE抑制肽的分離純化條件，以及利用質(zhì)譜鑒定其序列，下一步的工作將人工合成肽與分離的肽相對(duì)比，來進(jìn)一步驗(yàn)證肽序列的準(zhǔn)確性，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)降血壓功效，